a. Tổng hợp TA-PEG-Gelatin
Hình 2.1: Các bƣớc tổng hợp TA-PEG-Gelatin TA-PEG-Gelatin đƣợc tổng hợp qua 3 giai đoạn:
Tổng hợp NPC-PEG-NPC, hai nhóm OH cuối của PEG sẽ đƣợc hoạt hóa bởi pnitrophenyl chloroformate tạo sản phẩm trung gian PEG-NPC.
Tổng hợp TA-PEG-NPC, trong giai đoạn này, liên kết urethane đƣợc tạo thành từ phản ứng giữa nguyên tử nitơ trong phân tử tyramin và nhóm C=O của hợp chất NPC-PEG-NPC tạo sản phẩm TA-PEG-NPC.
Tổng hợp TA-PEG-Gelatin, trong giai đoạn phản ứng này, phản ứng urethane đƣợc tạo thành từ nhóm NH2 trên mạch gelatin và nhóm C=O của sản phẩm trung gian NPC-PEG-TA.
-Chuẩn bị dung dịch gelatin
Hoà tan 1 g gelatin (MW = 100.000) trong 50 mL nƣớc ở nhiệt độ 400C. Sau khi gelatin tan hoàn toàn, để nguội.
-Tổng hợp TA-PEG-Gelatin
Đun nóng chảy 10 g PEG (2,5 mmol) ở 65o
C kết hợp hút chân không liên tục trong 2 giờ. Sau khi PEG nóng chảy hoàn toàn cho 1,521 g NPC (7,5 mmol), khuấy và hút chân không trong 3 giờ. Cho 30 mL THF vào hỗn hợp tiếp tục khuấy trong khoảng 1 giờ, sau đó để nguội. PEG đã đƣợc hoạt hóa sẽ đƣợc kết tủa trong diethyl ether, kết tủa đƣợc lọc bằng phễu lọc hút chân không. Sau đó làm khô kết tủa bằng cách cô quay ở nhiệt độ phòng, chất bột rắn màu trắng thu đƣợc là NPCPEGNPC.
Hòa tan hoàn toàn 0,384g TA (2,8 mol) trong 5mL DMF và 35 mL THF, sau đó nhỏ từng giọt hỗn hợp trên vào 40 mL dung dịch có chứa 10 g NPCPEGNPC (2,3 mmol) trong THF, khuấy trong 24 giờ. Dùng phƣơng pháp cô quay ở 40oC để đuổi dung môi THF, sản phẩm sau phản ứng đƣợc kết tủa bởi diethyl ether, kết tủa đƣợc lọc bằng phễu lọc hút chân không. Sau đó kết tủa đƣợc làm khô bằng cách cô quay ở nhiệt độ phòng, chất bột rắn màu trắng thu đƣợc là NPC-PEG-TA.
Hòa tan 3,8 gam NPC-PEG-TA trong 30 mL nƣớc cất rồi nhỏ từng giọt vào dung dịch gelatin đã chuẩn bị, khuấy trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ lƣợng NPC còn dƣ sau phản ứng bằng cách thêm 0,5g TA trong nƣớc vào dung dịch và khuấy trong 12 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó tiến hành thẩm tách trong nƣớc cất với màng thẩm tách MWCO 14.000 Da để loại bỏ những tác chất thừa có trọng lƣợng phân tử dƣới 14.000 Da, khoảng 4 giờ thay nƣớc 1 lần, quá trình thẩm tách kéo dài 3 ngày. Dung dịch sau khi thẩm tách đƣợc đông sâu ở 80oC và tiến hành đông khô trong 24 giờ thu đƣợc sản phẩm TAPEGgelatin dạng xốp màu trắng.
Sử dụng phƣơng pháp 1
H-NMR xác định thành phần, cấu trúc của TAPEGgelatin.
Xác định lƣợng TA trong TA-PEG-Gelatin bằng phƣơng pháp UV-Vis. Đo độ hấp thu A của dung dịch TA-PEG-Gelatin ở nồng độ 1mg/mL và dùng đƣờng chuẩn của nồng độ TA và độ hấp thu A tại bƣớc sóng 270nm [phụ lục 14] để xác định lƣợng TA trong TA-PEG-Gelatin.
b. Tổng hợp in situ hydrogel TA-PEG-Gelatin
Hydrogel TA-PEG-Gelatin đƣợc điều chế trong sự hiện diện của HRP và H2O2 ở nhiệt độ phòng. Hòa tan 20 mg TA-PEG-Gelatin với 150μl dung dịch đệm muối phosphate pH = 7,4. Sau khi hòa tan, chia dung dịch làm hai phần bằng nhau. Dung dịch A chứa 75 µL TA-PEG-Gelatin đƣợc cho thêm 15μl H2O2. Dung dịch B chứa75 µL TA-PEG-Gelatin đƣợc cho thêm 15 μl HRP. Trộn lẫn hai dung dịch A và B vào nhau. Gel sẽ đƣợc hình thành nhanh chóng ở nhiệt độ phòng.
c.Tổng hợp in situ hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP
Hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP đƣợc điều chế trong sự hiện diện của HRP và H2O2 ở nhiệt độ phòng. Hòa tan 20 mg TA-PEG-Gelatin với 150μl dung dịch đệm muối phosphate pH = 7,4. Sau khi hòa tan, BCP đƣợc phân tán đều trong dung dịch TA-PEG-Gelatin bằng phƣơng pháp khuấy trộn, chia dung dịch làm hai phần bằng nhau. Dung dịch A chứa 75 µL TA-PEG- Gelatin/BCP đƣợc cho thêm 15μl H2O2. Dung dịch B chứa75 µL TA-PEG- Gelatin/BCP đƣợc cho thêm 15 μl HRP. Trộn lẫn hai dung dịch A và B vào nhau. Gel sẽ đƣợc hình thành nhanh chóng ở nhiệt độ phòng.