a.Tổng hợp TA-PEG-Chitosan oxi hóa
Hình 2.4: Các bƣớc tổng hợp TA-PEG-Chitosan oxi hóa TAPEGchitosan oxi hóa đƣợc tổng hợp qua 4 bƣớc:
Oxi hóa chitosan dùng NaIO4, ion periodate sẽ tấn công vào nhóm ancol lân cận và nhóm amine sẽ tách ra khỏi sƣờn carbon-carbon, dẫn đến hình thành nhóm dialdehyde. Mức độ oxi hóa của chitosan khoảng 14% đƣợc tính bằng tỷ lệ tích phân của proton H (glucosamine) trong TA-PEG-Chitosan và TA-PEG-Chitosan oxi hóa.
Tổng hợp NPC-PEG-NPC, hai nhóm OH cuối của PEG sẽ đƣợc hoạt hóa bởi pnitrophenyl chloroformate tạo sản phẩm trung gian PEG- NPC.
Tổng hợp TA-PEG-NPC, trong giai đoạn này, liên kết urethane đƣợc tạo thành từ phản ứng giữa nguyên tử nitơ trong phân tử tyramin và nhóm C=O của hợp chất NPC-PEG-NPC tạo sản phẩm TA-PEG-NPC.
-Chuẩn bị dung dịch chitosan oxi hóa
Hoà tan 0,7 g chitosan (MW = 100.000 300.000) trong 20 mL nƣớc pH=1, ở nhiệt độ phòng. Sau khi chitosan tan hoàn toàn, nhỏ từ từ từng giọt dung dịch NaOH 1M để điều chỉnh dung dịch chitosan về pH = 4.
Hòa tan 0,272 g NaIO4 (1,27 mmol) trong 40 mL nƣớc cất, bọc kỹ trong giấy nhôm để tránh ánh sáng rồi đƣa dung dịch về 4oC. Dung dịch chitosan có pH = 4 đƣợc bọc giấy nhôm để cách ly ánh sáng, đƣa nhiệt độ dung dịch về 4oC. Cho dung dịch NaIO4 vào dung dịch chitosan, khuấy trong 24 giờ trong môi trƣờng khí nitrogen ở 4oC. Thêm 10 mL ethylene glycol vào dung dịch phản ứng và khuấy trong 2 giờ. Dung dịch đƣợc thẩm tách bằng dung dịch NaCl và nƣớc cất trong 3 ngày với màng MWCO 14.000 Da, khoảng 4 giờ thay nƣớc một lần.
-Tổng hợp TA-PEG-Chitosan oxi hóa
Đun nóng chảy 10 g PEG (2,5 mmol) ở 65o
C kết hợp hút chân không liên tục trong 2 giờ. Sau khi PEG nóng chảy hoàn toàn cho 1,521 g NPC (7,5 mmol), tiếp tục khuấy và hút chân không liên tục trong 3 giờ. Cho 30 mL THF vào hỗn hợp tiếp tục khuấy trong khoảng 1 giờ, sau đó để nguội. PEG đã đƣợc hoạt hóa sẽ đƣợc kết tủa trong diethyl ether, kết tủa đƣợc lọc bằng phễu lọc hút chân không. Sau đó kết tủa đƣợc làm khô bằng cách cô quay ở nhiệt độ phòng, thu đƣợc chất bột rắn màu trắng là NPCPEGNPC.
Hòa tan hoàn toàn 0,384g TA (2,8 mol) trong 5mL DMF và 35 mL THF, sau đó nhỏ từng giọt hỗn hợp trên vào 40 mL dung dịch có chứa 10 g NPCPEGNPC (2,3 mmol) trong THF, khuấy trong 24 giờ. Dùng phƣơng pháp cô quay ở 40oC để đuổi dung môi THF, sản phẩm sau phản ứng đƣợc kết tủa bởi diethyl ether. Sau đó kết tủa đƣợc làm khô bằng cách cô quay ở nhiệt độ phòng, thu đƣợc chất bột rắn màu trắng là NPCPEGTA.
Hòa tan 3,8 gam NPCPEGTA trong 30 mL nƣớc cất rồi nhỏ từng giọt vào dung dịch chitosan oxi hóa đã chuẩn bị, kết hợp khuấy từ liên tục trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Để loại bỏ hoàn toàn một lƣợng nhỏ các nhóm NPC còn dƣ, dung dịch ở dạng huyền phù chứa 0,5 g TA đƣợc nhỏ giọt vào hỗn hợp và tiếp tục khuấy trong 12 giờ ở nhiệt độ phòng thu đƣợc dung dịch chứa TA-Te-Chitosan. Sau đó tiến hành thẩm tách bằng nƣớc muối và nƣớc cất với màng thẩm tách MWCO 14.000 Da, khoảng 4 giờ thay nƣớc 1 lần, quá trình thẩm tách kéo dài 3 ngày. Dung dịch sau khi thẩm tách đƣợc đông sâu ở −80oC và tiến hành đông khô trong 24 giờ thu đƣợc sản phẩm sản phẩm TAPEGchitosan dạng xốp màu trắng.
Sử dụng phƣơng pháp 1
H-NMR xác định thành phần, cấu trúc của TA- PEG-Chitosan oxi hóa.
Mức độ oxi hóa của chitosan đƣợc tính bằng tỷ lệ tích phân của proton H (glucosamine) trong mẫu TA-PEG-Chitosan và TA-PEG-Chitosan oxi hóa.
Xác định lƣợng TA trong TA-PEG-Chitosan oxi hóa bằng phƣơng pháp UV-Vis. Đo độ hấp thu A của dung dịch TA-PEG-Chitosan oxi hóa ở nồng độ 1mg/mL và dùng đƣờng chuẩn của nồng độ TA và độ hấp thu A tại bƣớc sóng 270nm [phụ lục 14] để xác định lƣợng TA trong TA-PEG- Chitosan oxi hóa.
b. Tổng hợp in situ TA-PEG-Chitosan oxi hóa
Hydrogel TA-PEG-Chitosan oxi hóa đƣợc điều chế trong sự hiện diện của HRP và H2O2 ở nhiệt độ phòng. Hòa tan 20 mg TA-PEG-Chitosan oxi hóa với 150μl dung dịch đệm muối phosphate pH = 7,4. Sau khi hòa tan, chia dung dịch làm hai phần bằng nhau. Dung dịch A chứa 75 µL TA-PEG- Chitosan oxi hóa đƣợc cho thêm 15μl H2O2. Dung dịch B chứa75 µL TA- PEG-Chitosan oxi hóa đƣợc cho thêm 15 μl HRP. Trộn lẫn hai dung dịch A và B vào nhau. Gel sẽ đƣợc hình thành nhanh chóng ở nhiệt độ phòng.
c. Tổng hợp in situ hydrogel TA-PEG-Chitosan oxi hóa/BCP
Hydrogel composit TA-PEG-Chitosan oxi hóa/BCP đƣợc điều chế trong sự hiện diện của HRP và H2O2 ở nhiệt độ phòng. Hòa tan 20 mg TA- PEG-Chitosan oxi hóa với 150μl dung dịch đệm muối phosphate pH = 7,4. Sau khi hòa tan, BCP đƣợc phân tán đều trong dung dịch TA-PEG-Chitosan oxi hóa bằng phƣơng pháp khuấy trộn, chia dung dịch làm hai phần bằng nhau. Dung dịch A chứa 75 µL TA-PEG-Chitosan oxi hóa/BCP đƣợc cho thêm 15μl H2O2. Dung dịch B chứa75 µL TA-PEG-Chitosan oxi hóa/BCP đƣợc cho thêm 15 μl HRP. Trộn lẫn hai dung dịch A và B vào nhau. Gel sẽ đƣợc hình thành nhanh chóng ở nhiệt độ phòng.
2.4 KHẢO SÁT CÁC TÍNH CHẤT CỦA HYDROGEL VÀ
HYDROGEL COMPOSIT