Lipit không xà phòng hóa được tách chiết từ sinh khối chủng PQ6 chiếm 4% sinh khối khô (4 mg/g). Squalene trong lipit không xà phòng hóa được tiến hành tinh sạch sơ bộ bằng cách lọc và rửa với dung môi n-hexan. Sau đó sản phẩm squalene thu được sau khi tinh sạch sơ bộ tiếp tục được làm sạch bằng cột sắc ký silicagel. Trong phương pháp sắc ký cột silica gel, cột thủy tinh được nạp chất hấp phụ là silicagel 60 (0,06-0,2 mm) đến 2/3 thể tích. Cột được rửa với dung môi nền là n-hexane trong 1 giờ nhằm ổn định cấu trúc. Mẫu được nạp lên cột và thôi mẫu bằng dung môi n-hexane. Hình 3.16 là hình minh họa cho quá trình tinh sạch bằng sắc ký cột silica gel. Squalene thu được sau khi tiến hành tinh sạch bằng cột sắc kí silicagel được kiểm tra độ sạch và xác định hàm lượng bằng TLC và HPLC (Hình 3.17.). Kết quả trên hình 3.17 cho thấy, squalene tinh sạch chỉ có 1 băng duy nhất và tương đồng với băng squalene chuẩn. Do đó, chúng tôi kết luận rằng squalene của chủng PQ6 sau khi tinh sạch qua cột silicagel có độ tinh khiết cao và có thể so sánh được với squalene chuẩn của hãng Sigma (độ tinh khiết > 98%).
Hình 3.17. Sắc ký lớp mỏng (A) và sắc ký đồ (B) của mẫu squalene từ chủng PQ6 sau khi tinh sạch qua cột silicagel.
(A): Sắc ký lớp mỏng (TLC) của mẫu squalene chuẩn (đường 1) và mẫu squalene từ chủng PQ6 sau khi tinh sạch qua cột silicagel (đường 2 đến 4). (B): Sắc ký đồ HPLC của mẫu squalene chuẩn và mẫu squalene được tách chiết từ chủng PQ6 sau khi tinh sạch qua sắc ký cột.
3.4. Quy trình tách chiết squalene từ sinh khối tảo dị dƣỡng S. mangrovei PQ6
Quá trình tách chiết squalene tinh sạch từ sinh khối VTB dị dưỡng S. mangrovei PQ6 được tiến hành gồm các bước: tách chiết lipit tổng số từ sinh khối chủng PQ6; tách chiết squalene thô từ lipit tổng số; tinh sạch squalene từ squalene thô. Trong đó, squalene thô hoặc squalene đã tinh sạch đều được kiểm tra sơ bộ hàm lượng bằng so mầu và sắc ký bản mỏng TLC và HPLC.
Qua rất nhiều thí nghiệm, chúng tôi đã thu được quy trình tách chiết squalene từ sinh khối VTB dị dưỡng S. mangrovei PQ6 được trình bày ở hình 3.18; 3.19; 3.20 như sau:
Hình 3.18. Tách lipit tổng số từ sinh khối chủng PQ6
Li tâm hôn hợp 4000 vòng/phút, trong 10 phút, lọc qua giấy lọc
Ө11
Ngâm chiết trên máy khuấy từ qua đêm, khuấy liên tục, 13h
Li tâm hỗn hợp 4000 vòng/phút, trong 10 phút, lọc qua giấy lọc Ө11 Cất quay 700C Thu lớp trên Bã sinh khối Bổ sung 1200ml hỗn hợp dd hóa chất methanol: chloroform tỉ lệ 2:1 (v/v) 80g SKK Hỗn hợp Lipit tổng số Thu lớp trên Bã sinh khối Làm bay hơi Methanol, chloroform Rửa 3 lần Bã sinh khối Bổ sung 200ml hỗn hợp dd hóa chất methanol: chloroform tỉ lệ 2:1 (v/v)
Hình 3.19 Tách squalene thô từ lipit tổng số của chủng PQ6
Thu lớp trên vòng/phút, trong 10 phút Li tâm hôn hợp 4000
Bã sinh khối Bổ sung 400ml hh dd hóa chất methanol: acetone tỉ lệ 7:3 (v/v), vontex hỗn hợp trong 5 phút Để hỗn hợp trong tủ - 200 C, trong 40h, thấy phân thành 2 lớp Lipit tổng số Hỗn hợp Li tâm hôn hợp 4000 vòng/phút, trong 10 phút Thu lớp trên Bã sinh khối Rửa 3 lần Bã sinh khối Bổ sung 100ml hỗn hợp dung dịch hóa chất methanol: aceton tỉ
lệ 7:3 (v/v) lạnh Cất quay 700C Squalene thô Làm bay hơi Methanol, aceton
Hình 3.20. Tinh sạch squalene thô từ lipit tổng số
Một số nguyên nhân được đưa ra để giải thích cho sự chênh lệch về hàm lượng squalene của sinh khối chủng S. mangrovei PQ6 theo phương pháp so màu so với phương pháp TLC, HPLC như sau: Ở phương pháp chạy sắc kí cần phải đi qua bước phân tách thành lipit không xà phòng hóa từ lipit tổng số. Sau đó mẫu lipit không xà phòng hóa mới được sử dụng để chạy TLC nhằm tách squalene ra khỏi các thành phần khác của lipit, phần silicagel chứa squalene lúc này được sử dụng để xác định hàm lượng bằng HPLC. Sau nhiều bước tách chiết và tinh sạch như vậy không tránh khỏi sự thất thoát dẫn đến việc giảm hàm lượng squalene. Trong khi đó, ở phương pháp so màu, bên cạnh squalene thì các thành phần khác của lipit như lanosterol hoặc ergosterol cũng cho phản ứng màu dương tính, vì
Bổ sung 200ml hexane: methanol tỉ lệ 2:1 (v/v), vontex hh trong 5 phút hợp trong 5 phút Để lắng hỗn hợp trong 10phút, thấy phân thành 2 lớp 5g squalene thô Hỗn hợp
Lớp dƣới Lớp trên Voltex, để lắng hỗn
hợp trong 10 phút, thấy phân thành 2
lớp Voltex, để lắng hỗn hợp
trong 10 phút, thấy phân thành 2 lớp Lớp dƣới Lớp dƣới Lớp trên Lớp trên Lặp lại 3 lần Phân tích squalene bằng phương pháp TLC và HPLC Lớp dưới là methanol chứa ít squalene Lớp trên là hexen chứa nhiều squalene Phân tích squalene bằng phương pháp TLC và HPLC
vậy, kết quả tính toán được có thể bao gồm cả squalene và sterol khác (Bhattacharjee et al., 2001) (10) nên hàm lượng squalene xác định được theo phương pháp so màu sẽ là cao hơn so với giá trị thực có về squalene được xác định bằng các phương pháp khác.
Nakazawa et al., (2012) [64] cũng đã xác định hàm lượng squalene trong một số chủng tảo bằng phương pháp TLC kết hợp sắc ký khí (GC), tương tự như phương pháp của chúng tôi. Kết quả nghiên cứu cho thấy, hàm lượng squalene của 3 chủng Aurantiochytrium limacinum 9F-4a, 4W-1b, 18W-13a và chủng
Schizochytrium limacinum SR21 đạt 0,6; 0,5; 171,1 và 0,2 mg/g SKK, tương ứng. Cũng theo một công bố của Yue và Jiang (2009) thì hàm lượng squalene đạt 1,17 mg/g sinh khối khô tảo sau 3 giờ bổ sung methyl jasmonate (MJA) ở thời điểm 48 giờ nuôi đối với chủng S. mangrovei [96]. Như vậy, hàm lượng squalene của chủng
S. mangrovei trong nghiên cứu của chúng tôi (33,134 mg/g SKK) là cao hơn so với chủng do Yue và Jiang (2009) công bố. Dựa trên các kết quả nghiên cứu của các tác giả nêu trên đã cho thấy quá trình sinh tổng hợp squalene có thể được tăng cường bằng việc tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy như là nhiệt độ, nồng độ glucose, tuổi tế bào hoăc dưới điều kiện có bổ sung một số chất ức chế quá trình tổng hợp squalene như MJA, terbinafine (TBNF) lên sinh trưởng và tích lũy squalene ở các chủng VTB khác nhau.
Vì vậy, để có thể sản xuất squalene từ chủng S. mangrovei PQ6 chúng tôi cần phải có những nghiên cứu tiếp tục theo hướng tối ưu hóa các điều kiện nuôi trồng chúng như là ảnh hưởng nhiệt độ, nồng độ glucose và thời gian nuôi cấy cũng như ảnh hưởng của một số chất ức chế tổng hợp squalene như methyl jasmonate, terbinafine… lên sinh trưởng và tích lũy squalene ở chủng PQ6 để thu sinh khối tảo cao, vừa có khả năng sản xuất squalene cao trong quy mô bình lên men 30 lít và 150 lít. Do vậy, những nghiên cứu nhằm nâng cao hàm lượng squalene trong sinh khối loài vi tảo này là cần thiết và sẽ được chúng tôi công bố trong những công trình tiếp theo.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
Qua các kết quả nghiên cứu được trình bày ở phần trên, chúng tôi xin rút ra một số kết luận như sau:
- Lựa chọn được phương pháp so màu nhanh, rẻ tiền để xác định hàm lượng squalene trong sinh khối tảo trong điều kiện Việt Nam; hàm lượng squalene của 5 chủng vi tảo biển quang tự dưỡng gồm Nannochloropsis oculata, Chlorella vulgaris, Tetraselmis convolutae, Isochrysis galbana, Dunaliella teriolecta và 2 loài dị dưỡng (Thraustochytrium striatum và Schizochytrium mangrovei) dao động từ 0,193-122 mg/g sinh khối khô;
- Chọn được một loài vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 trong tập đoàn giống của phòng Công nghệ Tảo có tiềm năng cho việc sản xuất lượng lớn squalene (122 mg/g sinh khối khô xác định theo phương pháp so màu);
- Có được phương pháp sàng lọc nhanh chủng tiềm năng cho sản xuất squalene bằng phương pháp so màu và sắc ký bản mỏng TLC với kích thước nhỏ có sử dụng chất chuẩn.
- Đã tiến hành phân tách, làm sạch và xác định hàm lượng squalene trong thành phần lipit không xà phòng hóa của sinh khối chủng PQ6 bằng phương pháp sắc kí bản mỏng và sắc kí lỏng cao áp.
- Hàm lượng squalene xác định theo TLC và HPLC của chủng PQ6 đạt 33,134 mg/g sinh khối khô và sản lượng squalene đạt 0,992 g/L khi được nuôi trồng ở bình lên men 30 Lít.
KIẾN NGHỊ
Từ các kết quả nghiên cứu đã thu được chúng tôi xin có một số kiến nghị cho các nghiên cứu tiếp theo như sau:
Cần tiếp tục nghiên cứu điều kiện nuôi trồng tối ưu cho thu nhận sinh khối chủng S. mangrovei PQ6 có sinh khối cao và hàm lượng squalene cao như: ảnh hưởng của nồng độ glucose; nhiệt độ; thời gian nuôi cấy; tuổi tế bào và có mặt một số chất ức chế tổng hợp squalene…
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Đặng Diễm Hồng và cs., (2011). Báo cáo tổng kết đề tài “Xây dựng tập đoàn giống vi tảo biển quang tự dưỡng, dị dưỡng của Việt Nam và nuôi sinh khối một số loài tảo dị dưỡng làm thức ăn trong nuôi trồng thủy sản” đề tài cấp Nhà nước thuộc chương trình Công nghệ sinh học trong nuôi trồng thủy sản năm 2008-2010 do Bộ NN-PTNT quản lý
2. Hoàng Lan Anh, Đinh Thị Thu Hằng, Đặng Diễm Hồng., (2009). Đánh giá hiệu quả sử dụng sinh khối vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 trong việc làm giàu Luân trùng (Brachionus plicatilis) và Artemia nauplii. Tuyển tập Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh học biển và phát triển bền vững. Nhà xuất bản KHTN và CN, Hà Nội, 27-28/11/2009. Trang 413-421.
3. Hoang Thi Lan Anh., (2014). Luận án Tiến sỹ sinh học. 150 trang
4. Ngô Thị Hoài Thu, Hoàng Thị Lan Anh, Đặng Diễm Hồng., (2010). Đánh giá hiệu quả sử dụng sinh khối vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei
PQ6 làm thức ăn cho tu hài (Lutraria rhynchaena Jonas, 1844). Tạp chí sinh học. 32(4): 83-88
Tiếng Anh
5. Ab Gapor M.D., Top., Leong L.W., Ong A.S.H., Kawada T., Watanabe H., Tsuchiya N., (1999). Production of high concentration tocopherols and tocotrienols from palm oil by-products. Malaysian patent No. my-11079-A
6. Aki T., Hachida K., Yoshinaga M., Katai Y., Yamasaki T., Kawamoto S., Kakizono T., Maoka T., Shigeta S., Suzuki O., Ono K. (2003).
Thraustochytrids as a potential source of carotenoids. J Am Oil Chem Soc. 80: 789-794
7. Alvaro L. Ronco., Eduardo De Stéfani., (2013). Squalene: a multi-task link in the crossroads of cancer and aging, Functional Foods in Health and Disease, 3(12): 462-476
8. Barnett G., (1972). Emollient creams and lotions. In comestic, Science and Techno-logy (Balsam, M S and Sagaran, E eds.). Second edition, Vol.1. Wiley-Interscience, p.27-104.
9. Beanerjee A, Sharma R., Chisti Y., Banerjee U.C., (2002). Botryococcus braunii - A renewable source of hydrocacbons and other chemicals. Crit. Rev. Biotechnol. 22: 245-279.
10. Bhattacharjee P., Shukla V.B., Singhal R.S., and Kulkarni P.R., (2001).
Studies on fermentative production of squalene. World Journal of Microbiology & Biotechnology. 17: 811-816
11. Bhattacharjee P., R.S. Singhal., (2003). Extraction of squalene from yeast by supercritical carbon dioxide. World Journal of Microbiology & Biotechnology.
19: 605–608.
12. Blasco. L., Duracher. L.., Forestier J.P., (2006). Skin constituents as cosmetic ingredients: part I: a study of bio-mimetic monoglycerides behavior at the squalene-water interface by the "pendant drop"method in a static mode.
J. Dispers. Sci. Technol. 27: 799-810.
13. Bligh E.G., Dyer W.J., (1959) A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37: 911-917
14. Bordier C.G., Sellier N., Foucault A.P., Goffic F.L., Le, Goffic F., (1996)
Purification and characterization of deep sea shark Centrophorus squamosusliver oil 1-O- alkylglycerol ether lipids. Lipids. 31 (5): 521-528.
15. Busquets A., Kein V., Closa M., del Arco A., Boronat A., Arro M., Ferrer A., (2008). Arabidopsis thaliana contain a single gene encoding squalene synthase. Plant Mol Biol, 67: 25-36
16. Chang M.H., Kim H.J., Jahng K.Y., Hong S.C., (2008). The isolation and chacracteration of Pseudozyma sp. JCC 207, a novel producer of squalene.
Appl Microbiol Biotechnol. 78: 963-972
17. Chen F., (1996). High cell density culture of microalge in hetero-trophic growth. Trends Biotechnol. 14: 421-426
Optimization of nitrogen source for enhanced production of squalene from thraustochytrids Aurantiochytrium sp. N. Biotechnol, 27(4): 382-9.
19. Christian M., (1982). Final report on the safety assessment of squalane and squalene. J Am Coll Toxicol, 1 (2): 37–56.
20. Cooksey K.E., Guckert J.B., Williams S.A., Callis P.R., (1987).
Fluorometric determination of the neutral lipid-content of microalgal cells using nile red. J Microbiol Meth. 6: 333–345.
21. Cutler R.G., (2005). Oxidative stress profiling: part I. Its potential importance in the optimization of human health. Ann N Y Acad Sci. 1055: 93-13
22. Dang Diem Hong., Hoang Thi Lan Anh., Ngo Thi Hoai Thu., (2011). Study on biological characteristics of heterotrophic marine microalga –
Schizochytrium mangrovei PQ6 isolated from Phu Quoc Island, Kien Giang province, Vietnam. J. of Phycology. 47 (4): 944-954
23. Dang Diem Hong, Dinh Thi Ngoc Mai, Le Thi Thom, Nguyen Cam Ha, Bui Dinh Lam, Luu Thi Tam, Hoang Thi Lan Anh, Ngo Thi Hoai Thu., (2013). Biodiesel production from Vietnam heterotrophic marine microalga
Schizochytrium mangrovei PQ6. J. of Bioscience and Bioengineering. 116 (2): 180-1185.
24. Das B., (2000). The science behind Squalene (The Human Antioxidant). ICBR Publishers, Toronto.
25. Das B., Yeger H., Baruchel H., Freedman M.H., Koren G., Baruchel S., (2003). In vitro cytoprotective activity of squalene on a bone marrow versus neuroblastoma model of cisplatin-induced toxicity: implications in cancer chemotherapy. Eur J Cancer. 39: 2556-2565.
26. Desai. KN, Wei. H, Lamartiniere C.A., (1996). The preventive and therapeutic potential of thesqualene-containing compound, Roidex, on tumor promotion and regression. Cancer Lett. 19: 93-96.
27. Dessi M.A., Deiana M., Day B.W., Rosa A., Banni S., Corongiu F.P., (2002) Oxidative stability of polyunsaturated fatty acids: effect of squalene.
Eur J Lipid Sci Tech. 104(8): 506-512.
enzyme in the cholesterol biosynthesis pathway. Clin Genet, 75 (1): 19-29.
29. Elsey D., Jameson D., Raleigh B., Cooney M.J. (2007). Fluorescent measurement of microalgal neutral lipids. J Microbiol Meth. 68: 639–642.
30. Fan K.W., Chen F., (2007). Production of high – value products by the marine microalgae thraustochytrids. In: Yang ST (ed) Bioprocessing for value- added products from renewable resources: new technologies and applications: 293-323
31. Fan K.W., Aki T., Chen F., (2010). Enhanced production of squalene in the thraustochytrid Aurantiochytrium mangrovei by medium optimization and treatment with terbinafine. World J Microbiol Biotechnol. 26: 1303-1309
32. Formaron-Bonnefond C., Demaretz V., Rosenfeld E., Salmon J.M., (2002). Oxygen addition and sterol synthesis in Saccharomyces cerevisiae
during enological fermentation. J Biosci Bioeng. 93: 176- 182
33. Gapor M.T., Hazrina A.R., (2000). Squalene in oils and fats. Palm Oil Developments. 32: 36-40.
34. Gershbein L.L., Sing E.J., (1969). Hydrocarbons of dogfish and cod livers and herring oil. J. Am. Oil Chem. Soc. 46: 554–557.
35. Goldstein J.L., Brown M.S., (1984). Progress in understanding the LDL receptor and HMG-CoA reductase, two membrane proteins that regulate the plasma cholesterol. J Lipid Res. 25:1450-1461.
36. Han-Ping He, Yizong zcai, Mei Sun, Harold Corke, (2002). Extraction and purification of squalene from Amaranthus Grain. J. Agric. Food Chem. 50: 368-372.
37. Hata S., Sanmiya K., Kouchi H., Matsuoka M., Yamanoto N., Izui K., (1997).
cDNA cloning of squalene synthase genes from mono and dicotyledonous plants, and expression of the gene in rice. Plant Cell Physiol. 38: 1409-1413
38. Hauß T., Dante S., Dencher N.A., Haines T.H., (2002). Squalane is in the midplane of the lipid bilayer: implications for its function as a proton permeability barrier. Biochim Biophys Acta. 1556(2-3):149-154.
matter from the oils of elasmobranch fish. Part I. A contribution to the study of the constitution of squalene (spinacene). J Chem Soc, 1630-1644.
40. Heller J.H., Pasternak V.Z., Ranson J.P., Heller M.S., (1963). A new reticulo-endothelial stimulating agent from shark livers. Nature (London), 199:904-905.
41. Hoang Thi Lan Anh, Ngo Thi Hoai Thu and Dang Diem Hong., (2010).
Isolation and screening of Schizochytrium microalgae from Vietnamese coasts for polyunsaturated fatty acid production. Journal of Science and Technology in the Tropics. Volume 6. p: 179-184
42. Honda D., Yokochi T., Nakahara T., Erata M., Higashihara T., (1998).
Schizochytrium limacinum sp. nov., a new thraustochytrid from a mangrove area in the west Pacific Ocean. Mycol Res 102:439-448
43. Howard G. M. and Poucher W. A., (1974). Perfumes, cosmetic and soaps. In the Raw Materials of Perfumery, Volume I. Chapman and Hall Ltd., p. 344.
44. Jara A.D.L., Mendoza H., Martel A., Molina C., (2003). Flow cytometric