Squalene được phân tích bằng sắc ký lỏng cao áp với cột sắc ký lỏng Thermo Hypersild Gold C18 (150 x 2,1 mm, 3 µm), pha động là dung dịch acetonitrile : nước (9:1, thể tích/thể tích), tốc độ dòng 250 µL/min. Sự nhận dạng squalene được thực hiện bằng cách sử dụng đầu dò PDA Accella với khoảng quét 190-400 nm, bước sóng UV đặt ở 198 nm và thời gian lưu của mẫu có chứa squalene được so sánh với thời gian lưu của squalene chuẩn. Hàm lượng squalene trong mẫu được xác định dựa trên đường chuẩn về mối tương quan giữa nồng độ của squalene chuẩn với diện tích peak tương ứng.
Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Excel 2007 và xử lý thống kê ANOVA ở mức ý nghĩa P ≤ 0,05.
CHƢƠNG III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Trong bộ sưu tập giống của Phòng Công nghệ Tảo, chúng tôi lựa chọn sàng lọc 7 loài vi tảo biển trong đó có 5 loài quang tự dưỡng và 2 loài dị dưỡng để xác định hàm lượng squalene theo định hướng tìm loài tiềm năng cho nuôi trồng trên quy mô lớn để thu sinh khối giàu squalene cho mục đích thương mại sản phẩm sau này. Chủng giống tảo sạch, thuần chủng được bảo quản và nhân giống sơ cấp ở điều kiện phòng thí nghiệm. Sinh khối tảo quang tự dưỡng được thu hoạch ở thời điểm trước pha cân bằng và sinh khối tảo dị dưỡng được thu hoạch sau 4 ngày nuôi cấy.
Hiện nay có rất nhiều phương pháp tách chiết và tinh sạch squalene như: phương pháp chưng cất khử mùi (deodorization distillate), sử dụng CO2 siêu tới hạn, sử dụng các dung môi hữu cơ như n-hexan và phương pháp sắc ký cột silica gel… Tuy nhiên, trong điều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam, để phù hợp với điều kiện kinh phí, chúng tôi nhận thấy cần phải thiết lập các phương pháp đơn giản, dễ làm, tương đối rẻ tiền nhằm tách chiết và tinh sạch squalene với mong muốn thương mại hóa sản phẩm này. Các phương pháp nghiên cứu được dùng để xác định hàm lượng squalene có trong sinh khối vi tảo biển quang tự dưỡng và dị dưỡng có thể là phương pháp so màu, TLC, sắc ký cột, HPLC.
3.1. Nuôi trồng đủ sinh khối vi tảo biển quang tự dƣỡng và dị dƣỡng làm nguyên liệu cho tách chiết squalene
Điều kiện nuôi cấy 5 loài vi tảo biển quang tự dưỡng và 2 loài dị dưỡng được sử dụng trong nghiên cứu được chỉ ra trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Danh sách 5 loài vi tảo biển quang tự dƣỡng, 2 loài dị dƣỡng và điều kiện nuôi cấy chúng trong điều kiện phòng thí nghiệm
STT Tên loài Điều kiện nuôi cấy
1 Chlorelavulgaris Môi trường Walne; 30‰; 300C; pH 7; 60 mol/m2s 2 Dunaliella tertiolecta Môi trường Walne; 30‰; 250C; pH = 7 – 9; 60
mol/m2s
3 Isochrysis galbana Môi trường Walne; 30‰; 300
C; pH 7; 60 mol/m2s 4 Nannochloropsisoculata Môi trường Walne; 30‰; 300C; pH 7; 100 mol/m2s 5 Tetraselmis convolutae Môi trường Walne; 30‰; 300C; pH 7; 60 mol/m2s 6 Schizochytrium
mangrovei PQ6
Môi trường M1; 280C; pH=6,5-7; lắc 200 vòng/phút
7 Thraustochytrium striatum
Môi trường Bajpai cải tiến; 280C; pH=6,5-7; lắc 200 vòng/ phút
Hình thái tế bào của 5 loài vi tảo biển quang tự dưỡng chụp dưới kính hiển vi quang học được chỉ ra trên hình 3.1.
Hình 3.1. Hình thái tế bào của 5 loài vi tảo biển quang tự dƣỡng chụp dƣới kính hiển vi quang học
x 1700 x 1500
Chlorella vulgaris Dunaliellatertiolecta Isochrysis galbana Nannochloropsis oculata Tetraselmisconvolutae
Hình chụp khuẩn lạc và tế bào của chủng Schizochytrium mangrovei và
Thraustochytrium striatum được chỉ ra trên hình 3.2.
A
B
Hình 3.2. Hình chụp khuẩn lạc và tế bào của chủng Schizochytrium mangrovei
PQ6 (A) và Thraustochytrium striatum (B)
Hình ảnh minh họa cho việc nuôi trồng thành công các loài vi tảo biển quang tự dưỡng (Hình 3.3) và dị dưỡng để cung cấp đủ sinh khối cho tách chiết và làm sạch squalene tiếp theo (Hình 3.4).
Hình 3.3. Hệ thống nuôi trồng các loài vi tảo biển quang tự dưỡng ở các quy mô bình từ 250 mL đến bình 10 lít
Hình 3.4. Hình ảnh minh họa nuôi trồng chủng Schizochytrium mangrovei PQ6 và Thraustochytrium striatum ở trong phòng thí nghiệm
Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn sàng lọc 7 loài vi tảo biển bao gồm 5 loài quang tự dưỡng Chlorella vulgaris, Dunaliella teriolecta, Isochrysis galbana, Nannochloropsis oculata, Tetraselmis convolutae và 2 loài dị dưỡng là
Schizochytrium mangrovei và Thraustochytrium striatum. Đây là các loài vi tảo đã được nghiên cứu sâu về đặc điểm sinh lý, sinh hóa. Một tiêu chí quan trọng để lựa chọn các loài vi tảo này để nghiên cứu là khả năng nuôi trồng trên qui mô lớn, năng suất sản xuất sinh khối cao, có thể được ứng dụng cho việc thương mại hóa sản phẩm squalene sau này.
Sinh khối tảo quang tự dưỡng sử dụng cho tách chiết lipit và xác định hàm lượng squalene được thu hoạch ở thời điểm trước pha cân bằng và sinh khối tảo dị dưỡng được thu hoạch sau 4 ngày nuôi cấy. Sinh khối khô được đặt trong desicator.
3.2. Sàng lọc nhanh các chủng vi tảo có tiềm năng sản xuất squalene cao 3.2.1. Phát hiện nhanh lipit nội bào bằng nhuộm Nile Red 3.2.1. Phát hiện nhanh lipit nội bào bằng nhuộm Nile Red
Phương pháp nhuộm Nile Red đã được áp dụng thành công để phát hiện sự có mặt của các hạt lipit trung tính trong tế bào nhiều loài vi tảo khác nhau [20], [54], [29]. Dưới kính hiển vi huỳnh quang vớ
450–490 nm và ánh sáng phát huỳnh quang của Nile Red ở bước sóng 540-640 nm,
2 ngày 1 ngày
0 ngày
các hạt lipit nội bào gồm triglyceride và các hydrocacbon như squalene có màu vàng sáng (Hình 3.5). Mức độ bắt màu vàng của các tế bào Schizochytrium mangrovei và Thraustochytrium striatum cao hơn so với 5 loài vi tảo quang tự dưỡng còn lại. Do vậy, có thể thấy rằng, hàm lượng lipit trong tế bào hai loài vi tảo dị dưỡng cao hơn nhiều so với các loài vi tảo quang tự dưỡng.
Kỹ thuật nhuộm lipit bằng Nile red là một phương pháp có hiệu quả, cho phép sàng lọc nhanh những loài vi tảo chứa hàm lượng lipit cao, nhằm mục đích tách chiết, xác định được hàm lượng squalene trong sinh khối vi tảo biển để bước đầu tìm ra được một số chủng tiềm năng trong việc thương mại hóa việc sản xuất squalene theo ứng dụng dược phẩm và thực phẩm chức năng.
A
B
Hình 3.5. Ảnh chụp tế bào dƣới kính hiển vi quang học (A) và kính hiển vi huỳnh quang sau khi nhuộm Nile Red (B) của 5 chủng vi tảo quang tự
dƣỡng và 2 chủng vi tảo dị dƣỡng với độ phóng đại 1500 lần.
với độ phóng đại 1500 lần
3.2.2. Phân tích lipit tổng số của các loài vi tảo biển đƣợc sử dụng trong nghiên cứu
Lipit tổng số của các loài vi tảo biển được sử dụng trong nghiên cứu đã được phân tích sơ bộ. Kết quả phân tích được chỉ ra trên bảng 3.2.
Bảng 3.2. Hàm lƣợng lipit của một số loài VTB đã đƣợc sử dụng trong nghiên cứu
Loài vi tảo Hàm lượng lipit (% khối lượng khô)
Nannochloropsis oculata 18,91±0,32 Chlorella vulgaris 16,12±0,56 Tetraselmis convolutae 16,67±0,86 Isochrysis galbana 9,99 ± 0,11 Dunaliella tertiolecta 16,12±0,56 Thraustochytrium striatum 50,88±0,26 Schizochytrium mangrovei PQ6 50,10±0,52
Schizochytrium mangrovei là loài vi tảo dị dưỡng được phân lập ở vùng huyện đảo Phú Quốc, Kiên Giang từ năm 2006-2008, thuộc tập đoàn giống vi tảo dị dưỡng của phòng Công nghệ Tảo. Các đặc điểm sinh học của loài vi tảo này đã được nghiên cứu tương đối kĩ. Việc nuôi trồng chúng cũng đã được tiến hành ở các quy mô khác nhau từ bình tam giác đến bình lên men 5, 10, 30 và 150 lít. Kết quả chỉ ra trên bảng 3.2 cho thấy, hàm lượng lipit trong sinh khối hai loài vi tảo dị dưỡng Thraustochytrium striatum và Schizochytrium mangrovei đạt cao nhất so với các loài vi tảo khác đã được sử dụng trong nghiên cứu. Do vậy, hai loài VTB này được coi là đối tượng tiềm năng cho việc sản xuất squalene sau này.
3.2.3. Xác định hàm lƣợng squalene trong sinh khối tảo bằng phƣơng pháp so màu
Việc xác định hàm lượng squalene bằng phương pháp so màu là đơn giản, chi phí thấp cho phép sàng lọc nhanh các chủng vi tảo có khả năng sản xuất squalene cao. Từ công bố của Rothblat và cs., (1962) [79], chúng tôi đã thiết lập lại phương pháp này trong điều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam. Bước xử lý mẫu
được tiến hành như sau: 1 mL axit sulfuric đậm đặc được bổ sung vào ống nghiệm chứa lipit và ống thí nghiệm được đặt trong bể ổn nhiệt ở 70oC trong 5 phút. Sau giai đoạn giữ ấm, tiến hành bổ sung từ từ 0,5 mL dung dịch formaldehyde và lắc đều ống chứa mẫu. Sau đó, ống chứa mẫu được đậy nắp và đặt trong nước sôi trong 10 phút. Ngay sau khi đưa mẫu khỏi bể ổn nhiệt, bổ sung 2,5 mL axit acetic lạnh để đưa thể tích mẫu lên 4 mL, trộn đều hỗn hợp và tiến hành xác định mật độ quang ở bước sóng 400 nm bằng máy quang phổ (Hitachi U-1100 Spectrophotometer, Nhật Bản). Hàm lượng squalene trong mẫu được xác định dựa trên giá trị OD400 thu được và đường chuẩn về tương quan giữa hàm lượng squalene chuẩn (C30H50, Sigma S3626) với giá trị mật độ quang đo được ở bước sóng 400 nm tương ứng.
Các giai đoạn khác nhau của phản ứng màu được chỉ ra ở hình 3.6 và 3.7.
r
Hình 3.6. Ảnh minh họa cho các giai đoạn khác nhau của phản ứng tạo màu đối với squalene chuẩn (1, 2, 3, 4, 5, 6 tƣơng ứng với các nồng độ 0,01; 0,04; 0,05; 0,06; 0,08; 0,10 mg) trong phƣơng pháp xác định squalene bằng so màu.
Dung dịch sau giai đoạn đặt trong nước sôi trong 10 phút Định mức mẫu bằng axit acetic và
xác định OD400
Bổ sung 1 ml H2SO4 vào ống nghiệm chứa squalene
Dung dịch sau giai đoạn làm ấm ở 700C trong 5 phút
Hình 3.7. Ảnh minh họa quá trình xác định hàm lƣợng squalene ở các loài tảo quang tự dƣỡng và dị dƣỡng bằng phƣơng pháp so màu
(1: Tetraselmis convolutae; 2: Dunaliella teriolecta; 3: Nannochloropsis oculata; 4: Isochrysis galbana; 5: Chlorella vulgaris; 6: Thraustochytrium striatum; 7:
Schizochytrium mangrovei PQ6).
Kết quả xây dựng được đường chuẩn về mối tương quan giữa nồng độ squalene và giá trị OD400 tương ứng được chỉ ra trên hình 3.8.
Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan giữa hàm lƣợng squalene chuẩn và OD400
Mẫu lipit ban đầu Bổ sung 1 ml H2SO4 vào ống nghiệm chứa lipit
Dung dịch sau giai đoạn làm ấm ở 70oC trong 5 phút
Dung dịch sau giai đoạn đặt trong nước sôi trong 10 phút và định mức mẫu bằng axit acetic
1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 y = 6.5893x + 0.1504 R2 = 0.9966 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 Hàm lượng squalene (mg) OD 400
Dựa vào đường chuẩn nêu trên và giá trị OD400 của các mẫu lipit tách chiết từ sinh khối tảo, hàm lượng squalene của các loài vi tảo nghiên cứu đã được xác định (Bảng 3.3). Kết quả thu được cho thấy S. mangrovei PQ6 là chủng vi tảo có hàm lượng squalene đạt cao nhất là 122 mg/g, tiếp theo là Thraustochytrium striatum (21,09 mg/g) và thấp nhất là N. oculata (0,193 mg/g).
Bảng 3.3. Hàm lƣợng squalene của 7 loài vi tảo biển nghiên cứu
Loài vi tảo Squalene (mg/g sinh khối khô)
N. oculata 0,193±0,002 C. vulgaris 3,300±0,023 T. convolutae 1,850±0,012 I. galbana 9,700±0,028 D. teriolecta 6,300±0,016 Thraustochytrium striatum 21,090±0,120 S. mangrovei PQ6 122,00±0,560
Nhiều nghiên cứu về khả năng sản xuất squalene ở các chủng vi tảo khác nhau cũng đã được công bố. Một số loài thuộc họ thraustochytrid như
Thraustochytrium ACEM 6063 có hàm lượng squalene đạt 0,1 mg/g sinh khối và
Aurantiochytrium mangrovei FB 1 đạt 0,162 mg/g sinh khối [55], [45]. Theo công bố của Nakazawa et al., (2012) [64] thì hàm lượng và hiệu suất squalene của chủng
Aurantiochytrium sp. 18W-13a là 171 mg/g sinh khối khô và 0,9 g/L, tương ứng trong điều kiện nuôi cấy tối ưu ở 25oC, 25-50% nước biển nhân tạo, glucose có nồng độ 2-6%. Ngoài ra, trong nghiên cứu mới nhất của Watanabe (2011) [93], một loài VTB dị dưỡng Aurantiochytrium sp. mới được phân lập từ vùng biển Okinawa của Nhật Bản có tốc độ sản xuất squalene lên đến 2,38 g/L, cao hơn so với chủng
Aurantiochytrium sp. 18W-13a được nêu ở trên. Như vậy, so với các công bố khác, hàm lượng squalene của các loài vi tảo trong nghiên cứu của chúng tôi là tương đối
cao, đặc biệt là hai loài VTB dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 và
Thraustochytrium striatum. Tuy nhiên, ngoài hàm lượng squalene thì khả năng nuôi trồng để thu sinh khối cũng là một khía cạnh cần phải quan tâm. Do vậy, chúng tôi cũng đã tiến hành các nghiên cứu nhằm đánh giá khả năng nuôi sinh khối của chủng này ở các hệ thống nuôi khác nhau.
Khảo sát sơ bộ khả năng nuôi trồng của 2 loài vi tảo biển dị dưỡng
Schizochytrium mangrovei PQ6 và Thraustochytrium striatum chúng tôi nhận thấy loài S. mangrovei PQ6 đã được nghiên cứu tương đối kỹ về nuôi trồng ở các quy mô bình tam giác và hệ thống lên men 5, 10 , 30 và 150 lít là tốt. Ví dụ ở các hệ thống bình lên men 30 và 150 lít với môi trường M12 có thành phần (g/L) gồm: glucose- 9; cao nấm men – 1; muối biển nhân tạo 17,5 (tương ứng với nồng độ muối 1,5% NaCl) đã cho sinh khối đạt 100-120 gr/L sau 4 ngày nuôi cấy với tốc độ sục 400 vòng/phút, nhiệt độ phòng và hoàn toàn đáp ứng được yêu cầu sử dụng sinh khối cho các mục đích nghiên cứu khác nhau. Trong khi đó, loài Thraustochytrium striatum cũng đã được nghiên cứu tối ưu hóa môi trường như GPY, M1, Bajpai với thành phần đã được trình bày ở phần vật liệu và phương pháp ở các cấp độ nuôi khác nhau. Các kết quả nghiên cứu thu được [1] đã cho thấy môi trường Bajpai với nồng độ độ cao nấm men 1%, nồng độ glucose 7% và nồng độ muối 0,5%; tốc độ khuấy liên tục khoảng 300- 400 vòng/phút, môi trường nuôi cấy được sục khí đã qua phin lọc vô trùng (hãng Sartorius Stedim Biotech, Đức), nhiệt độ được duy trì ở 28-300C là điều kiện tối thích cho chủng này phát triển và sinh khối sau 96 giờ nuôi cấy đạt 15,22±1,21 g/L.
Các kết quả nghiên cứu đã cho thấy, mặc dù hàm lượng lipit và squalene của chủng Thraustochytrium striatum cao hơn các loài VTB quang tự dưỡng khác nhưng khả năng tạo sinh khối thấp hơn rất nhiều so với chủng PQ6 (100-120 g sinh khối tươi/L). Chính vì vậy, chúng tôi đã lựa chọn nghiên cứu tách chiết và làm sach squalene từ loài S. mangrovei PQ6 để tìm kiếm chủng tiềm năng cho sản xuất squalene sau này.
3.2.4. Xác định hàm lƣợng squalene trong sinh khối bình lên men 30 lít bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng cao áp
3.2.4. 1. Tách chiết lipit không xà phòng hóa từ lipit tổng số
Squalene là một thành phần trong lipit không xà phòng hóa của vi tảo. Việc phân tách lipit không xà phòng hóa từ lipit tổng số nhằm mục đích nâng cao hàm lượng squalene và giảm sự phức tạp trong thành phần của mẫu lipit dùng cho phân tích sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng cao áp. Hình 3.9 là hình minh họa cho quá trình phân tách lipit không xà phòng hóa từ lipit tổng số.
Hình 3.9. Ảnh minh họa cho quá trình phân tách lipit không xà phòng hóa từ lipit tổng số
3.2.4.2. Xác định squalene bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng cao áp
Các phương pháp sắc ký cho phép phân tách, tinh sạch và định lượng squalene với độ chính xác cao. Kết quả chỉ ra trên hình 3.10 cho thấy mẫu lipit không xà phòng hóa tách chiết từ sinh khối PQ6 có xuất hiện băng tương đồng với băng squalene chuẩn. Đồng thời, phần silicagel có chứa các băng này tiếp tục được sử dụng để phân tích trên sắc ký lỏng cao áp.
Hỗn hợp trước phản ứng
Hỗn hợp phản ứng ở 600C trong 3 giờ
Hỗn hợp sau phản ứng
Thu hồi lớp trên có chứa
Hình 3.10. Sắc ký lớp mỏng mẫu lipit không xà phòng hóa tách chiết từ sinh khối chủng PQ6 (giếng 1: squalene chuẩn - 2 mg; giếng 2, 3, 4: lipit không xà