Sinh khối tảo quang tự dưỡng và dị dưỡng sử dụng cho tách chiết lipit và xác định hàm lượng squalene được thu hoạch ở thời điểm trước pha cân bằng và sinh khối tảo dị dưỡng được thu hoạch sau 4 ngày
(1959) [13] [1] 0,5 gam Na2SO4 – - 600 - .
2.2.6. Định lƣợng squalene bằng phƣơng pháp so màu [79]
1 mL axit sulfuric đậm đặc được bổ sung vào ống nghiệm chứa lipit và ống thí nghiệm được đặt trong bể ổn nhiệt ở 700C trong 5 phút. Sau giai đoạn giữ ấm, tiến hành bổ sung từ từ 0,5 mL dung dịch formaldehyde và lắc đều ống chứa mẫu. Sau đó, ống chứa mẫu được đậy nắp và đặt trong nước sôi trong 10 phút. Ngay sau khi đưa mẫu khỏi bể ổn nhiệt, bổ sung 2,5 mL axit acetic lạnh để đưa thể tích mẫu
lên 4 mL, trộn đều hỗn hợp và tiến hành xác định mật độ quang ở bước sóng 400 nm bằng máy quang phổ (Hitachi U-1100 Spectrophotometer, Nhật Bản). Hàm lượng squalene trong mẫu được xác định dựa trên giá trị OD tại bước sóng 400 nm thu được và đường chuẩn về tương quan giữa hàm lượng squalene chuẩn (C30H50, Sigma S3626) với giá trị mật độ quang đo được ở bước sóng 400 nm tương ứng.
2.2.7. Tách chiết và tinh sạch squalene thô [59]
2.2.7.1. Tách chiết squalene thô
Cân 8 g SKK (đã được nghiền khô mịn bằng máy xay sinh tố) cho vào chai pyrex 500mL. Bổ sung 120mL hỗn hợp dung dịch hóa chất methanol: chloroform tỉ lệ 2:1 (v/v), ngâm chiết trên máy khuấy từ qua đêm (máy khuấy từ đặt trong phòng box, bật điều hòa 270C, đặt tốc độ khuấy ở mức 3, khoảng 13h khuấy liên tục). Lấy mẫu ra khỏi máy khuấy từ, để phân lớp tự nhiên 30-45 phút. Hút phần dịch trong phía trên cho riêng vào 2 ống fancol, phần bã sinh khối phía dưới cho vào 2 ống fancol. Cả 4 ống li tâm 4000 vòng/phút, trong 10 phút. Sau li tâm, hút phần dịch trong phía trên của 2 ống dịch phần trên cho vào bình cầu 250mL, hút phần dịch trong phía trên của 2 ống chứa bã sinh khối lọc qua giấy lọc Ө 11 trên phễu thủy tinh. Rửa sinh khối 3 lần, mỗi lần bổ sung 20mL hỗn hợp dung dịch hóa chất methanol: chloroform tỉ lệ 2:1 (v/v) để rửa bã sinh khối. Li tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút. Hỗn hợp phân thành 2 lớp, hút lớp trên lọc qua giấy lọc Ө 11. Toàn bộ phần dịch trên tiến hành cất quay (nhiệt độ 700C, trong 15-20 phút) để loại bỏ hết dung môi và thu lipid tổng số.
Toàn bộ lipit tổng số thu được, bổ sung 40mL hỗn hợp dung dịch hóa chất methanol: acetone tỉ lệ 7:3 (v/v), vontex hỗn hợp trong 5 phút thấy có phân lớp chưa rõ ràng. Để hỗn hợp trong tủ - 200C, trong 40h, thấy phân thành 2 lớp. Lấy phần trên lọc qua giấy lọc GF/C, phần dưới tiến hành li tâm 6000 vòng/ phút trong 5 phút, thấy phân thành 2 lớp, lấy lớp trên. Rửa lớp dưới 3 lần, mỗi lần bổ sung 10mL hỗn hợp dung dịch hóa chất methanol:acetone tỉ lệ 7:3 (v/v) lạnh -200C, để rửa phần dưới, lắc đều, li tâm 6000 vòng/ phút trong 5 phút. Hỗn hợp phân thành 2 lớp, thu lớp trên. Toàn bộ phần dịch trên tiến hành cất quay (nhiệt độ 700
C, trong 15-20 phút) để loại bỏ hết dung môi và thu squalene thô.
2.2.7.2. Tinh sạch squalene thô
Cân 10,8mg squalene thô vào trong ống fancol 50ml. Bổ sung 20mL n- hexane: methanol tỉ lệ 2:1 (v/v), (chú ý lắc đều hỗn hợp dung môi trên trước khi đổ ra ống đong, vì 2 dung môi này có sự phân lớp), vontex mạnh trong 5 phút, để lắng 10 phút, thấy có sự phân thành 2 lớp: lớp methanol phía dưới chứa squlene với lượng ít, lớp n-hexane trên chứa nhiều squalene. Hút lớp trên ra ống fancol 50mL, lớp dưới ra ống fancol 15mL mới (để cho dễ phân lớp vì lớp này ít), vontex mạnh trong 5 phút, để lắng 10 phút, thấy có sự phân thành 2 lớp. Hút 2 lớp trên của 2 ống trên vào 1 ống fancol mới. Hút 2 lớp dưới của 2 ống trên vào một ống fancol mới. Bước này lặp lại 3 lần, ta có 1 ống fancol chứa lớp trên và 1 ống fancol chứa lớp dưới. Li tâm 4000 vòng/phút, trong 15 phút. Hút lớp trên ở cả 2 ống và định lượng thể tích (V) thu được ( lớp n-hexane chứa phần lớn squalene). Hút lớp dưới ở cả 2 ống và định lượng lại thể tích thu được (lớp methanol chứa ít squlene).
2.2.8. Xác định hàm lƣợng squalene bằng phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng
- Phân tách lipit không xà phòng hoá từ lipit tổng số [55]:
Lipit tổng số được cho phản ứng với dung dịch KOH 5% (khối lượng/thể tích) trong metanol-nước (4:1, thể tích/thể tích) ở 600C trong 3 giờ. Sau phản ứng, hỗn hợp được làm nguội đến nhiệt độ phòng và bổ sung thêm 4 mL nước cất. Các lipit không xà phòng hóa được thu nhận bằng cách sử dụng hỗn hợp dung môi n- hexane-cloroform (4:1, thể tích/thể tích). Dung dịch chứa lipit không xà phòng hóa được làm khô trên đĩa kính đồng hồ và hòa tan lại trong cloroform. Mẫu này được sử dụng để chạy sắc ký lớp mỏng.
- Chạy sắc ký lớp mỏng: Lipit không xà phòng hóa được phân tách trên bản sắc ký lớp mỏng (TLC) 20 x 20 cm có phủ silicagel 60 (Merck) với pha động là hệ dung môi n-hexan/diethyleter/axit acetic (70:30:4, thể tích/thể tích/thể tích). Các băng trên bản sắc ký được phát hiện bằng cách phun dung dịch H2SO4 20% và sấy khô ở 1000
2.2.9. Tinh sạch squalene bằng phƣơng pháp sắc kí cột
Squalene trong phần lipit không xà phòng hóa sẽ được tinh sạch bằng cột Silicagel 60, 0,06 - 0,2 mm cho sắc ký cột (70 - 230 mesh ASTM). 5g dung dịch không xà phòng hóa giàu squalene hòa tan trong 5mL n-hexan được đưa lên cột, rửa cột và thu phân đoạn với 100% n-hexan ở tốc độ dòng chảy 1,0 mL/min. Thu các phân đoạn trong ống facol 15mL. Sử dụng sắc ký bản mỏng để xác định sự có mặt của các phân đoạn thu được.
2.2.10. Xác định squalene bằng sắc ký lỏng cao áp
Squalene được phân tích bằng sắc ký lỏng cao áp với cột sắc ký lỏng Thermo Hypersild Gold C18 (150 x 2,1 mm, 3 µm), pha động là dung dịch acetonitrile : nước (9:1, thể tích/thể tích), tốc độ dòng 250 µL/min. Sự nhận dạng squalene được thực hiện bằng cách sử dụng đầu dò PDA Accella với khoảng quét 190-400 nm, bước sóng UV đặt ở 198 nm và thời gian lưu của mẫu có chứa squalene được so sánh với thời gian lưu của squalene chuẩn. Hàm lượng squalene trong mẫu được xác định dựa trên đường chuẩn về mối tương quan giữa nồng độ của squalene chuẩn với diện tích peak tương ứng.
Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Excel 2007 và xử lý thống kê ANOVA ở mức ý nghĩa P ≤ 0,05.
CHƢƠNG III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Trong bộ sưu tập giống của Phòng Công nghệ Tảo, chúng tôi lựa chọn sàng lọc 7 loài vi tảo biển trong đó có 5 loài quang tự dưỡng và 2 loài dị dưỡng để xác định hàm lượng squalene theo định hướng tìm loài tiềm năng cho nuôi trồng trên quy mô lớn để thu sinh khối giàu squalene cho mục đích thương mại sản phẩm sau này. Chủng giống tảo sạch, thuần chủng được bảo quản và nhân giống sơ cấp ở điều kiện phòng thí nghiệm. Sinh khối tảo quang tự dưỡng được thu hoạch ở thời điểm trước pha cân bằng và sinh khối tảo dị dưỡng được thu hoạch sau 4 ngày nuôi cấy.
Hiện nay có rất nhiều phương pháp tách chiết và tinh sạch squalene như: phương pháp chưng cất khử mùi (deodorization distillate), sử dụng CO2 siêu tới hạn, sử dụng các dung môi hữu cơ như n-hexan và phương pháp sắc ký cột silica gel… Tuy nhiên, trong điều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam, để phù hợp với điều kiện kinh phí, chúng tôi nhận thấy cần phải thiết lập các phương pháp đơn giản, dễ làm, tương đối rẻ tiền nhằm tách chiết và tinh sạch squalene với mong muốn thương mại hóa sản phẩm này. Các phương pháp nghiên cứu được dùng để xác định hàm lượng squalene có trong sinh khối vi tảo biển quang tự dưỡng và dị dưỡng có thể là phương pháp so màu, TLC, sắc ký cột, HPLC.
3.1. Nuôi trồng đủ sinh khối vi tảo biển quang tự dƣỡng và dị dƣỡng làm nguyên liệu cho tách chiết squalene
Điều kiện nuôi cấy 5 loài vi tảo biển quang tự dưỡng và 2 loài dị dưỡng được sử dụng trong nghiên cứu được chỉ ra trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Danh sách 5 loài vi tảo biển quang tự dƣỡng, 2 loài dị dƣỡng và điều kiện nuôi cấy chúng trong điều kiện phòng thí nghiệm
STT Tên loài Điều kiện nuôi cấy
1 Chlorelavulgaris Môi trường Walne; 30‰; 300C; pH 7; 60 mol/m2s 2 Dunaliella tertiolecta Môi trường Walne; 30‰; 250C; pH = 7 – 9; 60
mol/m2s
3 Isochrysis galbana Môi trường Walne; 30‰; 300
C; pH 7; 60 mol/m2s 4 Nannochloropsisoculata Môi trường Walne; 30‰; 300C; pH 7; 100 mol/m2s 5 Tetraselmis convolutae Môi trường Walne; 30‰; 300C; pH 7; 60 mol/m2s 6 Schizochytrium
mangrovei PQ6
Môi trường M1; 280C; pH=6,5-7; lắc 200 vòng/phút
7 Thraustochytrium striatum
Môi trường Bajpai cải tiến; 280C; pH=6,5-7; lắc 200 vòng/ phút
Hình thái tế bào của 5 loài vi tảo biển quang tự dưỡng chụp dưới kính hiển vi quang học được chỉ ra trên hình 3.1.
Hình 3.1. Hình thái tế bào của 5 loài vi tảo biển quang tự dƣỡng chụp dƣới kính hiển vi quang học
x 1700 x 1500
Chlorella vulgaris Dunaliellatertiolecta Isochrysis galbana Nannochloropsis oculata Tetraselmisconvolutae
Hình chụp khuẩn lạc và tế bào của chủng Schizochytrium mangrovei và
Thraustochytrium striatum được chỉ ra trên hình 3.2.
A
B
Hình 3.2. Hình chụp khuẩn lạc và tế bào của chủng Schizochytrium mangrovei
PQ6 (A) và Thraustochytrium striatum (B)
Hình ảnh minh họa cho việc nuôi trồng thành công các loài vi tảo biển quang tự dưỡng (Hình 3.3) và dị dưỡng để cung cấp đủ sinh khối cho tách chiết và làm sạch squalene tiếp theo (Hình 3.4).
Hình 3.3. Hệ thống nuôi trồng các loài vi tảo biển quang tự dưỡng ở các quy mô bình từ 250 mL đến bình 10 lít
Hình 3.4. Hình ảnh minh họa nuôi trồng chủng Schizochytrium mangrovei PQ6 và Thraustochytrium striatum ở trong phòng thí nghiệm
Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn sàng lọc 7 loài vi tảo biển bao gồm 5 loài quang tự dưỡng Chlorella vulgaris, Dunaliella teriolecta, Isochrysis galbana, Nannochloropsis oculata, Tetraselmis convolutae và 2 loài dị dưỡng là
Schizochytrium mangrovei và Thraustochytrium striatum. Đây là các loài vi tảo đã được nghiên cứu sâu về đặc điểm sinh lý, sinh hóa. Một tiêu chí quan trọng để lựa chọn các loài vi tảo này để nghiên cứu là khả năng nuôi trồng trên qui mô lớn, năng suất sản xuất sinh khối cao, có thể được ứng dụng cho việc thương mại hóa sản phẩm squalene sau này.
Sinh khối tảo quang tự dưỡng sử dụng cho tách chiết lipit và xác định hàm lượng squalene được thu hoạch ở thời điểm trước pha cân bằng và sinh khối tảo dị dưỡng được thu hoạch sau 4 ngày nuôi cấy. Sinh khối khô được đặt trong desicator.
3.2. Sàng lọc nhanh các chủng vi tảo có tiềm năng sản xuất squalene cao 3.2.1. Phát hiện nhanh lipit nội bào bằng nhuộm Nile Red 3.2.1. Phát hiện nhanh lipit nội bào bằng nhuộm Nile Red
Phương pháp nhuộm Nile Red đã được áp dụng thành công để phát hiện sự có mặt của các hạt lipit trung tính trong tế bào nhiều loài vi tảo khác nhau [20], [54], [29]. Dưới kính hiển vi huỳnh quang vớ
450–490 nm và ánh sáng phát huỳnh quang của Nile Red ở bước sóng 540-640 nm,
2 ngày 1 ngày
0 ngày
các hạt lipit nội bào gồm triglyceride và các hydrocacbon như squalene có màu vàng sáng (Hình 3.5). Mức độ bắt màu vàng của các tế bào Schizochytrium mangrovei và Thraustochytrium striatum cao hơn so với 5 loài vi tảo quang tự dưỡng còn lại. Do vậy, có thể thấy rằng, hàm lượng lipit trong tế bào hai loài vi tảo dị dưỡng cao hơn nhiều so với các loài vi tảo quang tự dưỡng.
Kỹ thuật nhuộm lipit bằng Nile red là một phương pháp có hiệu quả, cho phép sàng lọc nhanh những loài vi tảo chứa hàm lượng lipit cao, nhằm mục đích tách chiết, xác định được hàm lượng squalene trong sinh khối vi tảo biển để bước đầu tìm ra được một số chủng tiềm năng trong việc thương mại hóa việc sản xuất squalene theo ứng dụng dược phẩm và thực phẩm chức năng.
A
B
Hình 3.5. Ảnh chụp tế bào dƣới kính hiển vi quang học (A) và kính hiển vi huỳnh quang sau khi nhuộm Nile Red (B) của 5 chủng vi tảo quang tự
dƣỡng và 2 chủng vi tảo dị dƣỡng với độ phóng đại 1500 lần.
với độ phóng đại 1500 lần
3.2.2. Phân tích lipit tổng số của các loài vi tảo biển đƣợc sử dụng trong nghiên cứu
Lipit tổng số của các loài vi tảo biển được sử dụng trong nghiên cứu đã được phân tích sơ bộ. Kết quả phân tích được chỉ ra trên bảng 3.2.
Bảng 3.2. Hàm lƣợng lipit của một số loài VTB đã đƣợc sử dụng trong nghiên cứu
Loài vi tảo Hàm lượng lipit (% khối lượng khô)
Nannochloropsis oculata 18,91±0,32 Chlorella vulgaris 16,12±0,56 Tetraselmis convolutae 16,67±0,86 Isochrysis galbana 9,99 ± 0,11 Dunaliella tertiolecta 16,12±0,56 Thraustochytrium striatum 50,88±0,26 Schizochytrium mangrovei PQ6 50,10±0,52
Schizochytrium mangrovei là loài vi tảo dị dưỡng được phân lập ở vùng huyện đảo Phú Quốc, Kiên Giang từ năm 2006-2008, thuộc tập đoàn giống vi tảo dị dưỡng của phòng Công nghệ Tảo. Các đặc điểm sinh học của loài vi tảo này đã được nghiên cứu tương đối kĩ. Việc nuôi trồng chúng cũng đã được tiến hành ở các quy mô khác nhau từ bình tam giác đến bình lên men 5, 10, 30 và 150 lít. Kết quả chỉ ra trên bảng 3.2 cho thấy, hàm lượng lipit trong sinh khối hai loài vi tảo dị dưỡng Thraustochytrium striatum và Schizochytrium mangrovei đạt cao nhất so với các loài vi tảo khác đã được sử dụng trong nghiên cứu. Do vậy, hai loài VTB này được coi là đối tượng tiềm năng cho việc sản xuất squalene sau này.
3.2.3. Xác định hàm lƣợng squalene trong sinh khối tảo bằng phƣơng pháp so màu
Việc xác định hàm lượng squalene bằng phương pháp so màu là đơn giản, chi phí thấp cho phép sàng lọc nhanh các chủng vi tảo có khả năng sản xuất squalene cao. Từ công bố của Rothblat và cs., (1962) [79], chúng tôi đã thiết lập lại phương pháp này trong điều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam. Bước xử lý mẫu
được tiến hành như sau: 1 mL axit sulfuric đậm đặc được bổ sung vào ống nghiệm chứa lipit và ống thí nghiệm được đặt trong bể ổn nhiệt ở 70oC trong 5 phút. Sau giai đoạn giữ ấm, tiến hành bổ sung từ từ 0,5 mL dung dịch formaldehyde và lắc đều ống chứa mẫu. Sau đó, ống chứa mẫu được đậy nắp và đặt trong nước sôi trong 10 phút. Ngay sau khi đưa mẫu khỏi bể ổn nhiệt, bổ sung 2,5 mL axit acetic lạnh để đưa thể tích mẫu lên 4 mL, trộn đều hỗn hợp và tiến hành xác định mật độ quang ở bước sóng 400 nm bằng máy quang phổ (Hitachi U-1100 Spectrophotometer, Nhật Bản). Hàm lượng squalene trong mẫu được xác định dựa trên giá trị OD400 thu được và đường chuẩn về tương quan giữa hàm lượng squalene chuẩn (C30H50, Sigma S3626) với giá trị mật độ quang đo được ở bước sóng 400 nm tương ứng.
Các giai đoạn khác nhau của phản ứng màu được chỉ ra ở hình 3.6 và 3.7.
r
Hình 3.6. Ảnh minh họa cho các giai đoạn khác nhau của phản ứng tạo màu đối với squalene chuẩn (1, 2, 3, 4, 5, 6 tƣơng ứng với các nồng độ 0,01; 0,04; 0,05; 0,06; 0,08; 0,10 mg) trong phƣơng pháp xác định squalene bằng so màu.
Dung dịch sau giai đoạn đặt trong nước sôi trong 10 phút Định mức mẫu bằng axit acetic và
xác định OD400
Bổ sung 1 ml H2SO4 vào ống nghiệm chứa squalene
Dung dịch sau giai đoạn làm ấm ở 700C trong 5 phút
Hình 3.7. Ảnh minh họa quá trình xác định hàm lƣợng squalene ở các loài tảo quang tự dƣỡng và dị dƣỡng bằng phƣơng pháp so màu
(1: Tetraselmis convolutae; 2: Dunaliella teriolecta; 3: Nannochloropsis oculata; 4: Isochrysis galbana; 5: Chlorella vulgaris; 6: Thraustochytrium striatum; 7:
Schizochytrium mangrovei PQ6).
Kết quả xây dựng được đường chuẩn về mối tương quan giữa nồng độ squalene và giá trị OD400 tương ứng được chỉ ra trên hình 3.8.