Các phương pháp sắc ký cho phép phân tách, tinh sạch và định lượng squalene với độ chính xác cao. Kết quả chỉ ra trên hình 3.10 cho thấy mẫu lipit không xà phòng hóa tách chiết từ sinh khối PQ6 có xuất hiện băng tương đồng với băng squalene chuẩn. Đồng thời, phần silicagel có chứa các băng này tiếp tục được sử dụng để phân tích trên sắc ký lỏng cao áp.
Hỗn hợp trước phản ứng
Hỗn hợp phản ứng ở 600C trong 3 giờ
Hỗn hợp sau phản ứng
Thu hồi lớp trên có chứa
Hình 3.10. Sắc ký lớp mỏng mẫu lipit không xà phòng hóa tách chiết từ sinh khối chủng PQ6 (giếng 1: squalene chuẩn - 2 mg; giếng 2, 3, 4: lipit không xà
phòng hóa tách từ sinh khối chủng PQ6)
Squalene được phân tích bằng sắc ký lỏng cao áp với cột sắc ký lỏng Thermo Hypersild Gold C18 (150 x 2,1 mm, 3 µm), pha động là dung dịch acetonitrile : nước (9:1, v/v), tốc độ dòng 250 µL/min. Sự nhận dạng squalene được thực hiện bằng cách sử dụng đầu dò PDA Accella với khoảng quét 190-400 nm, bước sóng UV đặt ở 198 nm và thời gian lưu của mẫu có chứa squalene được so sánh với thời gian lưu của squalene chuẩn (C30H50, Sigma S3626). Hàm lượng squalene trong mẫu được xác định dựa trên đường chuẩn về mối tương quan giữa nồng độ của squalene chuẩn với diện tích peak tương ứng. Hình 3.11 là đường chuẩn về mối tương quan giữa hàm lượng squalene và diện tích peak được phân tích bằng HPLC. Hình 3.12 và 3.13 là sắc kí đồ của squalene chuẩn và squalene có trong sinh khối tảo.
Squalene
Hình 3.11. Đƣờng chuẩn về mối tƣơng quan giữa hàm lƣợng squalene và diện tích peak
Hình 3.12. Sắc ký đồ của squalene chuẩn xác định bằng sắc ký lớp mỏng TLC và HPLC squalene Y = 378037+432055*X R^2 = 0.9992 W: Equal 0 10 20 30 40 ppm 0 5000000 10000000 15000000 20000000 A re a
Hình 3.13. Sắc ký đồ của mẫu PQ6 squalene đƣợc phân tách bằng sắc ký lớp mỏng và xác định bằng HPLC
Chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng squalene của chủng PQ6 bằng phương pháp TLC và HPLC. Kết quả nghiên cứu thu được được chỉ ra trên bảng 3.4.
Bảng 3.4. Hàm lượng squalene của chủng PQ6 được phân tích bằng TLC và HPLC
Squalene Hàm lượng (mg/g)
Squalene tính theo lipit không xà phòng hóa 828,351 Squalene tính theo lipit tổng số 65,597 Squalene tính theo sinh khối khô 33,134
Kết quả cho thấy các điều kiện cho chạy sắc ký lỏng cao áp là phù hợp để phân tách và xác định squalene từ lipit không xà phòng hóa của chủng PQ6. Trên sắc ký đồ của mẫu silicagel đem phân tích có peak bằng thời gian lưu của squalene chuẩn. Hàm lượng squalene của S. mangrovei PQ6 sau khi phân tách bằng TLC và định lượng bằng HPLC là 33,134 mg/g sinh khối khô (bảng 3.4), thấp hơn so với giá trị tính toán được theo phương pháp so màu. Điều này được giải thích là do sự thất thoát của squalene sau các bước tách chiết và tinh sạch. Ngoài ra, trong phương pháp so màu, bên cạnh squalene thì các thành phần khác của lipit như lanosterol hoặc ergosterol cũng cho phản ứng màu dương tính, vì vậy, kết quả tính toán được
có thể bao gồm cả squalene và sterol khác [10]. Với hàm lượng squalene là 33,134 mg/g SKK, chủng PQ6 có sản lượng squalene đạt 0,992 g/L khi được nuôi trồng ở bình lên men 30 Lít.