Vi tảo Botrycoccus braunii có khả năng tổng hợp squalene cao tuy nhiên nó là môt cơ thể quang tự dưỡng bắt buộc có tốc độ sinh trưởng thấp, việc mở rộng nuôi trồng trên quy mô lớn gặp nhiều khó khăn nên việc thương mại hóa sản phẩm này cũng cần phải được xem xét kỹ lưỡng [9]. Trong khi đó, một số các loài vi tảo dị dưỡng như thraustochytrids được xem như là các nhà máy tế bào tiềm năng cho sản xuất các chất có giá trị cao trong đó có squalene [6], [17]. Chi tảo thraustochytrid có tốc độ sinh trưởng cao trong điều kiện nuôi cấy dị dưỡng có bổ sung nguồn cacbon hữu cơ và không cần có ánh sáng bởi vì cơ thể chúng thiếu bộ máy quang hợp cho cố định carbon [30], [56]. Một số loài thuộc họ thraustochytrid như Thraustochytrium ACEM 6063 có hàm lượng squalene đạt đến 0,1 mg/g sinh khối và Aurantiochytrium mangrovei FB 1 - 0,162 mg/g sinh khối [45], [55].
Việc tối ưu các thành phần nuôi cấy trong môi trường đã làm tăng hàm lượng squalene [18]. Jiang và cộng sự (2004) cũng đã công bố hàm lượng squalene của
Schizochytrium phụ thuộc vào thời gian nuôi cấy như sau 3 ngày hàm lượng squalene đạt 0,16 mg/g SKK và sau 5 ngày hàm lượng này là 0,04 mg/g SKK sau 5 ngày nuôi cấy [45].
Các nguồn ni tơ khác nhau như monosodium glutamate, cao nấm men, tryptone có ảnh hưởng lên sinh trưởng và hàm lượng squalene của Aurantiochytrium
sp.. Hàm lượng và hiệu suất squalene của loài này đạt được là 0,72 mg/g và 5,90 mg/L, tương ứng, [18]. Kết quả thu được nêu trên cao hơn nhiều so với những công bố trước đó và đây là cơ sở khoa học cho việc tối ưu hóa điều kiện nuôi trồng ở quy mô công nghiệp cho sản xuất squalene ở Aurantiochytrium sp.
Ngoài ra, hướng nghiên cứu các tác nhân khác nhau làm tăng cường quá trình sinh tổng hợp squalene trên các cơ thể sinh vật hoang dại phân lập được từ các vùng biển tự nhiên cũng đã được nghiên cứu. Theo hướng này tác giả Yue và Jiang (2009) [96] đã công bố tác dụng của methyl jasmonate (MJA) lên sinh tổng hợp squalene ở vi tảo biển Schizochytrium mangrovei. Hàm lượng squalene cực đại đạt được là 1,17±0,06 mg/g sinh khối khô tế bào sau 3 giờ có bổ sung MJA (0,1 mM) ở
48 giờ nuôi cấy và cao hơn 60% so với công thức đối chứng. Việc tăng hàm lượng squalene là do tăng hoạt tính của squalene synthase (SS).
Terbinafine hydrochloride ((E)-N-(6,6-dimethyl-2-hepten-4-ynyl)-N- methyl-1-naphthylmethylamine hydrochloride) được biết là chất ức chế lên hoạt tính của enzyme squalene monooxygenase và tích lũy squalene ở loài A. mangrovei FB3 [31]. Squalene monooxygenase (EC 1.14.99.7) là enzyme chìa khóa trong quá trình tổng hợp sterol và xúc tác cho quá trình oxy hóa squalene đến 2, 3 oxidosqualene khi có mặt oxy phân tử và NADPH. Vì vậy, khi ức chế enzyme này xảy ra sẽ ngăn cản việc chuyển hóa tiếp squalene và dẫn đến việc tích lũy một lượng lớn trong tế bào.
Khi bổ sung 100 mg terbinafine vào môi trường nuôi loài A. mnagrrovei, hàm lượng squalene đạt cao nhất là 0,53 mg/g sinh khối khô [31].
Nakazawa và cộng sự (2013) đã tiến hành sàng lọc khả năng tích lũy squalene cao ở 176 chủng Thraustochytrid từ các vùng khác nhau trong khu vực Châu Á. Kết quả nghiên cứu thu được cho thấy trong số 176 chủng được nghiên cứu có có 38 chủng được đánh giá là “+” (cao), 29 là “±” (trung bình) và 109 được đánh giá là “-” (thấp); sự tích lũy squalene có liên quan chặt chẽ đến khu vực địa lý, sinh thái nơi phân bố chủng. Hầu hết các chủng có hàm lượng squalene cao được phân lập từ vùng bờ biển Okinawa, một khu vực cận nhiệt đới của Nhật Bản trong khi các chủng chứa lượng squalene thấp hơn được phân lập từ các khu vực địa lý rộng từ vùng nhiệt đới đến cận Bắc Cực. Một số chủng Aurantiochytrium có chứa hàm lượng cao squalene đã được phát hiện như Yonez5-1 (317,74 mg/g sinh khối), 9-w4b (316,21 mg/g sinh khối), AR-4a (316,64 mg/g sinh khối), 9W-3a (236,04 mg/g sinh khối) và Aurantiochytrium sp.18w -13a (198 mg/g sinh khối) [63], [64]. Nakazawa và cộng sự (2012) đã công bố rằng chủng Aurantiochytrium sp.18w-13a ở điều kiện nuôi cấy tối ưu (25 độ C; 25-50% nước biển nhân tạo, glucose có nồng độ 2-6% có hàm lượng và sản lượng squalene đạt gần 171 mg/g sinh khối khô và 0,9 mg/l, tương ứng. Hàm lượng này cao hơn bất kỳ các công bố trước đó ở thraustochytrids, thực vật và nấm men. Ngoài ra, công trình công bố mới nhất của Nakazawa và cộng sự (2013) cũng cho thấy một số chủng vi tảo biển dị dưỡng
Aurantiochytrium sp. được phân lập từ vùng biển của Nhật Bản có khả năng tích lũy cao squalene với hiệu suất đạt 1-2,38 g/l, cao hơn 0,9 g/l của chủng 18w-13 nêu trên [93].
1.5. Một số hƣớng nghiên cứu về squalene trên thế giới
Việc nghiên cứu để tách chiết squalene nhanh, có độ tinh sạch cao và giá thành rẻ từ các nguồn nguyên liệu khác nhau cũng đã được tập trung nghiên cứu. Ví dụ như theo thông báo của Lu và cs., (2003) [59] đã cho thấy squalene thô được tách chiết từ vi tảo biển Thraustochytrium ATCC 26185 bằng các dung môi hữu cơ có thành phần như n-hexane-methanol (2:1, v/v) đi kèm theo một số phương pháp làm sạch tiếp theo có hiệu xuất đạt 0,2 mg squalene với độ sạch đạt 96% từ 150 mg squalene thô (chiếm 0,14% squalene) với khả năng thu hồi đạt 95%. Nhiều công bố hiện nay cho thấy việc sử dụng C02 tới hạn trong quá trình tách chiết squalene từ nấm men cũng làm tăng hiệu xuất tách chiết đạt đến 430,52 µg/g sinh khối khô tế bào nấm men, rút ngắn được thời gian tách chiết so với sử dụng dung môi chloroform-methanol (2:1) [11].
Hiện nay để xác định hàm lượng squalene trong thực phẩm (có nguồn gốc từ thực vật) như bí ngô (89,0 mg/100 g), ngũ cốc, đậu đỏ, các loại hạt, rau, vi sinh vật… chủ yếu sử dụng phương pháp GC, HPLC với các detector quang diode [80], [59] và xác định cấu trúc squalene bằng khối phổ (GC-mass spectrometer; GC-MS) [55]. Đây là các phương pháp hiện đại, có độ chính xác cao nhưng đòi hỏi chi phí cao về kinh phí cho các thí nghiệm.
Các nghiên cứu về vai trò điều khiển các gen mã hóa cho squalene synthase (BfSSI) lên sinh tổng hợp phytosterol và triterpene ở Bupleurum falcatum cũng đã được Kim và cs., (2011) [50] công bố. Kết quả nghiên cứu của các tác giả nêu trên đã chỉ ra rằng việc biểu hiện của BfSSI tốt ở B. falcatum đã điều khiển các gene cuối nguồn (downstream gene) mạnh hơn so với việc xử lý MJA trong quá trình sinh tổng hợp triterpene và phytosterol. Việc nghiên cứu gen mã hóa cho squalene synthase ở cây mô hình Arabidopsis thaliana [15]; biểu hiện của gen này ở lúa [37]; nghiên cứu quá trình điều khiển hoạt động của gen này ở Saccharomyces cerevisiae
Như vậy, sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử nhằm tăng cường biểu hiện một số gen mã hóa cho các enzyme chính tham gia trong con đường trao đổi chất của sinh tổng hợp phytosterol và triterpene ở thực vật nhằm làm tăng hàm lượng squalene cũng đã cho thấy việc thương mại hóa sản phẩm này bằng con đường công nghệ sinh học cũng có một triển vọng áp dụng nào đó trong tương lai gần.
Như vậy, để có thể xác định được những cơ thể vi sinh vật có khả năng sản xuất squalene, cần phải sàng lọc được các chủng từ môi trường biển tự nhiên khác nhau. Các chủng phân lập được cần phải xác định được khả năng sản xuất trên quy mô lớn các axít béo hoặc lipít. Trong số các chủng phân lập được, cần xác định được các chủng mới có khả năng sản xuất một lượng lớn squalene hay không? Tốc độ sản xuất squalene của các chủng phân lập được cũng cần phải được khẳng định về tiềm năng của nó như là một nguồn tự nhiên cho sản xuất thương mại hóa squalene có chất lượng cao.
1.6. Nghiên cứu trong nƣớc về squalene
Ở Việt Nam cho đến nay chưa có một công trình nghiên cứu khoa học nào về squalene từ các cơ thể sống (kể cả động, thực vật và vi sinh vật). Trong khi đó, Việt Nam lại là một quốc gia biển, rất đa dạng về tảo biển, có rất nhiều loài đặc hữu hứa hẹn là nguồn tiềm năng sản xuất squalene cho dược phẩm. Việc sàng lọc nhanh được các chủng tảo có khả năng tổng hợp squalene tự nhiên cao cũng như nghiên cứu điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sinh khối tảo giàu squalene là rất cần thiết.
Việc sàng lọc nhanh các chủng/loài vi tảo biển có hàm lượng squalene cao cho mục đích sản xuất thương mại squalene sau này cần phải hội tụ một số tiêu chuẩn như sau:
- Phải là chủng/loài có chứa hàm lượng squalene cao;
- Các chủng/loài có hàm lượng squalene cao phải có khả năng nuôi trồng trên quy mô lớn với năng xuất cao;
- Các chủng/loài tiềm năng cho sản xuất squalene trên quy mô lớn phải có giá thành cho sản xuất sinh khối tảo rẻ có thể chấp nhận được nếu nuôi trồng trên quy mô lớn.
Với một tập đoàn giống vi tảo biển quang tự dưỡng và dị dưỡng sẵn có của phòng thí nghiệm Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học được thừa hưởng từ các đề tài nghiên cứu trước đây, một số loài vi tảo biển quang tự dưỡng hội tụ được một số tiêu chuẩn về năng xuất nuôi trồng, khả năng nuôi trồng trên quy mô lớn với công nghệ nuôi trồng đã được nghiên cứu tương đối kỹ ở Việt Nam, chúng tôi sẽ tập trung vào một số loài như Nannocloropsis oculata, Chlorella sp., Tetraselmis sp…
Tuy nhiên, với một số loài vi tảo biển quang tự dưỡng nêu trên việc sản xuất đủ sinh khối của chúng theo con đường quang tự dưỡng sẽ có giá thành cao. Do vây, những loài/chủng vi tảo biển dị dưỡng đã là đối tượng tiềm năng cho sản xuất sinh khối giàu axit béo không bão hòa đa nối đôi để làm thực phẩm chức năng cho người và động vật nuôi trong nuôi trồng thủy sản; làm nguyên liệu cho sản xuất biodiesel cũng như dầu sinh học giàu omega-3 và omega-6 (như chi
Schizochytrium; Thraustochytrium) sẽ được tập trung sàng lọc đầu tiên về hàm lượng squalene của chúng để cho phép rút ngắn thời gian sàng lọc được chủng/loài tiềm năng cho sản xuất squalene trong một thời gian ngắn, giảm chi phí cho việc sàng lọc.
Việc thiết lập lại những phương pháp xác định hàm lượng squalene theo phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và rẻ tiền trong điều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam [79]; tách chiết và làm sạch squalene bằng sắc ký bản mỏng TLC; sắc ký cột bên cạnh các phương pháp hiện đại như GC, HPLC, GC –MS cũng cần được tiến hành.
1.7. Một số giới thiệu về chi vi tảo biển dị dƣỡng Schizochytrium của Việt Nam
Giới chromista (còn được gọi là Stramenopilia) gồm tảo vàng, tảo khuê, tảo lục, Haptophyte, Cryptophyte, Oomycetes, Thraustochytrids. Schizochytrium là một vi tảo biển dị dưỡng thuộc họ Thraustochytriacaea [60]. Loài tảo này có đặc điểm là thali (tản) đơn tâm, có thể gắn kết các thể nền thông qua mạng lưới ngoại chất xuất phát từ cơ quan tử gọi là sagenogenetosome [62]. Chi schizochytrium được đặc trưng bởi sự phân đôi liên tiếp của một tế bào sinh dưỡng hình thành nên cụm tế bào, mỗi cụm tế bào sẽ phát triển thành túi động bào tử hoặc động bào tử (Hình 1.4). Động bào tử có
một lông roi phía trước dài và một lông roi sau ngắn. Phương thức sinh sản bằng động bào tử đặc trưng cho mỗi loài và được sử dụng để phân loại [76].
Hình 1.4. Hình thái của tế bào Schizochytrium [87]
Phân tích phát sinh loài dựa trên gen 18S rRNA đã chỉ ra rằng Schizocytrium
có một mối quan hệ gần gũi với thraustochytrid. Hiện nay, thraustochytrid được xem là thành viên của ngành Heterokontophyta thuộc giới Stramenopila (hoặc chromista). Hiện nay có 5 loài thuộc chi Schizochytrium đã được mô tả bao gồm S. mangrovei, S. aggretatum, S. octosporum, S. minitum và S. limacinum [42], [75].
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng khả năng sản xuất squalene từ các chủng Schizochytrium có thể được sử dụng như là nguồn thay thế cho sản xuất squalene thương mại. Ở Việt Nam chủng Schizochytrium mangrovei PQ6 đã được công về đặc điểm sinh học, phân loại chính xác tên khoa học của chủng; khả năng ứng dụng của chủng trong sản xuất biodiesel, dầu sinh học giàu axit béo, ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản đã được công bố [2], [3], [4], [22], [23], [41] . Đây là một chủng vi tảo tiềm năng, dễ nuôi trồng để thu sinh khối, lượng sinh khối tươi đạt 100-150g/L tương đương với sinh khối khô là 30-50 g/L, hàm lượng lipit có thể lên tới 70% sinh khối khô ở các hệ thống bình lên men với thể tích khác nhau cho đến 150 lit. Vì vậy, chúng tôi sử dụng loài vi tảo biển này để nuôi trồng trên qui mô lớn và sử dụng sinh khối của chúng như là nguồn nguyên liệu cho tách chiết và tinh sạch squalene.
Nhằm đi đến mục tiêu lớn là cung cấp được các sản phẩm giàu squalene phục vụ cho sức khỏe cộng đồng từ nguồn tài nguyên thiên nhiên sẵn có trong nước trong đó có tảo, chúng tôi mong muốn tiến hành đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu sàng lọc squalene từ một số chủng vi tảo biển phân lập ở Việt Nam” nhằm cung cấp cơ sở khoa học ban đầu về hàm lượng squalene ở vi tảo biển Việt Nam; có được các phương pháp nghiên cứu phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm về tách chiết, xác định squalene trong sinh khối vi tảo biển để bước đầu tìm ra được một số chủng tiềm năng cho việc nghiên cứu sâu hơn theo định hướng sử dụng squalene làm thực phẩm chức năng và dược phẩm trong tương lai ở Việt Nam.
CHƢƠNG II
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị 2.1.1. Chủng tảo và điều kiện nuôi cấy 2.1.1. Chủng tảo và điều kiện nuôi cấy
7 loài vi tảo biển phân lập từ vùng biển Việt Nam bao gồm 5 loài vi tảo biển quang tự dưỡng là Chlorella vulgaris Beijerinck 1890 HP, Dunaliella teriolecta
Butcher 1959 HP, Isochrysis galbana Parke 1949, Nannochloropsis oculata
(Droop) Hibberd 1981 HP, Tetraselmis convolutae (Parke & Manton) Noris, Hori & Chihara 1980; và 2 loài vi tảo biển dị dưỡng là Schizochytrium mangrovei
Raghukumar 1988, Thraustochytrium striatum Scheneider 1967 thuộc trong tập đoàn giống của Phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp.
Các loài vi tảo biển quang tự dưỡng được nuôi trong các bình tam giác 1.000 mL chứa 500 mL môi trường Walne có thành phần như sau (g/lít nước biển): NaNO3 (hoặc KNO3)-0,1; Na2EDTA.2H2O-0,045; H3BO3-0,0336; NaH2PO4.2H2O- 0,02; FeCl3.6H2O-0,0013; MnCl2.4H2O-0,00036; vi lượng gồm (μg/L): ZnCl2-2,1; CoCl2.6H2O-2; (NH4)6 Mo7O2.4H2O-0,9; CuSO4.5H2O-2 và vitamin B12-10 μg/L; vitamin B1-0,2 mg/L; biotin-0,2 μg/L; chiếu sáng với cường độ 60 µmol/m2s, chu kì sáng: tối 12/12 giờ ở 28-300C [1].
Các loài vi tảo biển dị dưỡng được nuôi trong các bình tam giác 1000 mL chứa 300 mL môi trường M1 (3% glucose, 1% cao nấm men, muối biển nhân tạo 17,5 g/L - tương đương với hàm lượng NaCl là 1,5%), chế độ lắc 200 vòng/phút ở 25-280C [1].
Đối với Thraustochytrium được nuôi trên môi trường Bajpai cải tiến với các thành phần như sau: 2,5% NaCl, 0,5% MgSO4.7H2O, 0,01% KCl, 0,01% KH2PO4, 0,02% CaCO3, 0,02% (NH4)2SO4, 0,2% sodium glutamate, 0,01% NaHCO3, 2%
glucose, 0,2% cao nấm men, vitamin B1 1mg/L, vitamin B2 0,1 mg/L [1], chế độ lắc 200 vòng/ phút ở 25-280C.
2.1.2. Hóa chất
- Các hoá chất vô cơ tinh khiết dùng để pha môi trường Walne do Trung Quốc và Việt Nam sản xuất.
- Các hoá chất tinh sạch để pha môi trường nuôi cấy vi tảo biển dị dưỡng bao gồm: glucose (Việt Nam), cao nấm men (Merck, Đức), muối biển nhân tạo (Tropic Marine, Aquarientechk, Wartenberg, Đức), polypepton (Merck, Đức).
- Hóa chất dùng để tách chiết lipit, lipit không xà phòng hóa và nhuộm tế bào: chloroform, methanol, n-hexan, NaCl 0,9%, Na2SO4, KOH.
- Hóa chất Nile Red (9-(Diethylamino)-5H benzo [α] phenoxazin-5-one, Sigma) dùng cho nhuộm lipit trong tế bào vi tảo.
- Hóa chất squalene chuẩn (C30H50, Sigma S3626) dùng cho định lượng squalene trong sinh khối tảo bằng phương pháp so màu, phương pháp TLC và HPLC.
- Hóa chất dùng cho việc định lượng squalene bằng phương pháp so màu, phương pháp phân tích bằng sắc kí bản mỏng, sắc kí lỏng cao áp: H2SO4, formaldehyde, axit acetic, diethylether.
2.1.3. Thiết bị
Các thiết bi và dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu gồm: Buồng đếm