3.2.1. Phát hiện nhanh lipit nội bào bằng nhuộm Nile Red
Phương pháp nhuộm Nile Red đã được áp dụng thành công để phát hiện sự có mặt của các hạt lipit trung tính trong tế bào nhiều loài vi tảo khác nhau [20], [54], [29]. Dưới kính hiển vi huỳnh quang vớ
450–490 nm và ánh sáng phát huỳnh quang của Nile Red ở bước sóng 540-640 nm,
2 ngày 1 ngày
0 ngày
các hạt lipit nội bào gồm triglyceride và các hydrocacbon như squalene có màu vàng sáng (Hình 3.5). Mức độ bắt màu vàng của các tế bào Schizochytrium mangrovei và Thraustochytrium striatum cao hơn so với 5 loài vi tảo quang tự dưỡng còn lại. Do vậy, có thể thấy rằng, hàm lượng lipit trong tế bào hai loài vi tảo dị dưỡng cao hơn nhiều so với các loài vi tảo quang tự dưỡng.
Kỹ thuật nhuộm lipit bằng Nile red là một phương pháp có hiệu quả, cho phép sàng lọc nhanh những loài vi tảo chứa hàm lượng lipit cao, nhằm mục đích tách chiết, xác định được hàm lượng squalene trong sinh khối vi tảo biển để bước đầu tìm ra được một số chủng tiềm năng trong việc thương mại hóa việc sản xuất squalene theo ứng dụng dược phẩm và thực phẩm chức năng.
A
B
Hình 3.5. Ảnh chụp tế bào dƣới kính hiển vi quang học (A) và kính hiển vi huỳnh quang sau khi nhuộm Nile Red (B) của 5 chủng vi tảo quang tự
dƣỡng và 2 chủng vi tảo dị dƣỡng với độ phóng đại 1500 lần.
với độ phóng đại 1500 lần
3.2.2. Phân tích lipit tổng số của các loài vi tảo biển đƣợc sử dụng trong nghiên cứu
Lipit tổng số của các loài vi tảo biển được sử dụng trong nghiên cứu đã được phân tích sơ bộ. Kết quả phân tích được chỉ ra trên bảng 3.2.
Bảng 3.2. Hàm lƣợng lipit của một số loài VTB đã đƣợc sử dụng trong nghiên cứu
Loài vi tảo Hàm lượng lipit (% khối lượng khô)
Nannochloropsis oculata 18,91±0,32 Chlorella vulgaris 16,12±0,56 Tetraselmis convolutae 16,67±0,86 Isochrysis galbana 9,99 ± 0,11 Dunaliella tertiolecta 16,12±0,56 Thraustochytrium striatum 50,88±0,26 Schizochytrium mangrovei PQ6 50,10±0,52
Schizochytrium mangrovei là loài vi tảo dị dưỡng được phân lập ở vùng huyện đảo Phú Quốc, Kiên Giang từ năm 2006-2008, thuộc tập đoàn giống vi tảo dị dưỡng của phòng Công nghệ Tảo. Các đặc điểm sinh học của loài vi tảo này đã được nghiên cứu tương đối kĩ. Việc nuôi trồng chúng cũng đã được tiến hành ở các quy mô khác nhau từ bình tam giác đến bình lên men 5, 10, 30 và 150 lít. Kết quả chỉ ra trên bảng 3.2 cho thấy, hàm lượng lipit trong sinh khối hai loài vi tảo dị dưỡng Thraustochytrium striatum và Schizochytrium mangrovei đạt cao nhất so với các loài vi tảo khác đã được sử dụng trong nghiên cứu. Do vậy, hai loài VTB này được coi là đối tượng tiềm năng cho việc sản xuất squalene sau này.
3.2.3. Xác định hàm lƣợng squalene trong sinh khối tảo bằng phƣơng pháp so màu
Việc xác định hàm lượng squalene bằng phương pháp so màu là đơn giản, chi phí thấp cho phép sàng lọc nhanh các chủng vi tảo có khả năng sản xuất squalene cao. Từ công bố của Rothblat và cs., (1962) [79], chúng tôi đã thiết lập lại phương pháp này trong điều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam. Bước xử lý mẫu
được tiến hành như sau: 1 mL axit sulfuric đậm đặc được bổ sung vào ống nghiệm chứa lipit và ống thí nghiệm được đặt trong bể ổn nhiệt ở 70oC trong 5 phút. Sau giai đoạn giữ ấm, tiến hành bổ sung từ từ 0,5 mL dung dịch formaldehyde và lắc đều ống chứa mẫu. Sau đó, ống chứa mẫu được đậy nắp và đặt trong nước sôi trong 10 phút. Ngay sau khi đưa mẫu khỏi bể ổn nhiệt, bổ sung 2,5 mL axit acetic lạnh để đưa thể tích mẫu lên 4 mL, trộn đều hỗn hợp và tiến hành xác định mật độ quang ở bước sóng 400 nm bằng máy quang phổ (Hitachi U-1100 Spectrophotometer, Nhật Bản). Hàm lượng squalene trong mẫu được xác định dựa trên giá trị OD400 thu được và đường chuẩn về tương quan giữa hàm lượng squalene chuẩn (C30H50, Sigma S3626) với giá trị mật độ quang đo được ở bước sóng 400 nm tương ứng.
Các giai đoạn khác nhau của phản ứng màu được chỉ ra ở hình 3.6 và 3.7.
r
Hình 3.6. Ảnh minh họa cho các giai đoạn khác nhau của phản ứng tạo màu đối với squalene chuẩn (1, 2, 3, 4, 5, 6 tƣơng ứng với các nồng độ 0,01; 0,04; 0,05; 0,06; 0,08; 0,10 mg) trong phƣơng pháp xác định squalene bằng so màu.
Dung dịch sau giai đoạn đặt trong nước sôi trong 10 phút Định mức mẫu bằng axit acetic và
xác định OD400
Bổ sung 1 ml H2SO4 vào ống nghiệm chứa squalene
Dung dịch sau giai đoạn làm ấm ở 700C trong 5 phút
Hình 3.7. Ảnh minh họa quá trình xác định hàm lƣợng squalene ở các loài tảo quang tự dƣỡng và dị dƣỡng bằng phƣơng pháp so màu
(1: Tetraselmis convolutae; 2: Dunaliella teriolecta; 3: Nannochloropsis oculata; 4: Isochrysis galbana; 5: Chlorella vulgaris; 6: Thraustochytrium striatum; 7:
Schizochytrium mangrovei PQ6).
Kết quả xây dựng được đường chuẩn về mối tương quan giữa nồng độ squalene và giá trị OD400 tương ứng được chỉ ra trên hình 3.8.
Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan giữa hàm lƣợng squalene chuẩn và OD400
Mẫu lipit ban đầu Bổ sung 1 ml H2SO4 vào ống nghiệm chứa lipit
Dung dịch sau giai đoạn làm ấm ở 70oC trong 5 phút
Dung dịch sau giai đoạn đặt trong nước sôi trong 10 phút và định mức mẫu bằng axit acetic
1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 y = 6.5893x + 0.1504 R2 = 0.9966 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 Hàm lượng squalene (mg) OD 400
Dựa vào đường chuẩn nêu trên và giá trị OD400 của các mẫu lipit tách chiết từ sinh khối tảo, hàm lượng squalene của các loài vi tảo nghiên cứu đã được xác định (Bảng 3.3). Kết quả thu được cho thấy S. mangrovei PQ6 là chủng vi tảo có hàm lượng squalene đạt cao nhất là 122 mg/g, tiếp theo là Thraustochytrium striatum (21,09 mg/g) và thấp nhất là N. oculata (0,193 mg/g).
Bảng 3.3. Hàm lƣợng squalene của 7 loài vi tảo biển nghiên cứu
Loài vi tảo Squalene (mg/g sinh khối khô)
N. oculata 0,193±0,002 C. vulgaris 3,300±0,023 T. convolutae 1,850±0,012 I. galbana 9,700±0,028 D. teriolecta 6,300±0,016 Thraustochytrium striatum 21,090±0,120 S. mangrovei PQ6 122,00±0,560
Nhiều nghiên cứu về khả năng sản xuất squalene ở các chủng vi tảo khác nhau cũng đã được công bố. Một số loài thuộc họ thraustochytrid như
Thraustochytrium ACEM 6063 có hàm lượng squalene đạt 0,1 mg/g sinh khối và
Aurantiochytrium mangrovei FB 1 đạt 0,162 mg/g sinh khối [55], [45]. Theo công bố của Nakazawa et al., (2012) [64] thì hàm lượng và hiệu suất squalene của chủng
Aurantiochytrium sp. 18W-13a là 171 mg/g sinh khối khô và 0,9 g/L, tương ứng trong điều kiện nuôi cấy tối ưu ở 25oC, 25-50% nước biển nhân tạo, glucose có nồng độ 2-6%. Ngoài ra, trong nghiên cứu mới nhất của Watanabe (2011) [93], một loài VTB dị dưỡng Aurantiochytrium sp. mới được phân lập từ vùng biển Okinawa của Nhật Bản có tốc độ sản xuất squalene lên đến 2,38 g/L, cao hơn so với chủng
Aurantiochytrium sp. 18W-13a được nêu ở trên. Như vậy, so với các công bố khác, hàm lượng squalene của các loài vi tảo trong nghiên cứu của chúng tôi là tương đối
cao, đặc biệt là hai loài VTB dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 và
Thraustochytrium striatum. Tuy nhiên, ngoài hàm lượng squalene thì khả năng nuôi trồng để thu sinh khối cũng là một khía cạnh cần phải quan tâm. Do vậy, chúng tôi cũng đã tiến hành các nghiên cứu nhằm đánh giá khả năng nuôi sinh khối của chủng này ở các hệ thống nuôi khác nhau.
Khảo sát sơ bộ khả năng nuôi trồng của 2 loài vi tảo biển dị dưỡng
Schizochytrium mangrovei PQ6 và Thraustochytrium striatum chúng tôi nhận thấy loài S. mangrovei PQ6 đã được nghiên cứu tương đối kỹ về nuôi trồng ở các quy mô bình tam giác và hệ thống lên men 5, 10 , 30 và 150 lít là tốt. Ví dụ ở các hệ thống bình lên men 30 và 150 lít với môi trường M12 có thành phần (g/L) gồm: glucose- 9; cao nấm men – 1; muối biển nhân tạo 17,5 (tương ứng với nồng độ muối 1,5% NaCl) đã cho sinh khối đạt 100-120 gr/L sau 4 ngày nuôi cấy với tốc độ sục 400 vòng/phút, nhiệt độ phòng và hoàn toàn đáp ứng được yêu cầu sử dụng sinh khối cho các mục đích nghiên cứu khác nhau. Trong khi đó, loài Thraustochytrium striatum cũng đã được nghiên cứu tối ưu hóa môi trường như GPY, M1, Bajpai với thành phần đã được trình bày ở phần vật liệu và phương pháp ở các cấp độ nuôi khác nhau. Các kết quả nghiên cứu thu được [1] đã cho thấy môi trường Bajpai với nồng độ độ cao nấm men 1%, nồng độ glucose 7% và nồng độ muối 0,5%; tốc độ khuấy liên tục khoảng 300- 400 vòng/phút, môi trường nuôi cấy được sục khí đã qua phin lọc vô trùng (hãng Sartorius Stedim Biotech, Đức), nhiệt độ được duy trì ở 28-300C là điều kiện tối thích cho chủng này phát triển và sinh khối sau 96 giờ nuôi cấy đạt 15,22±1,21 g/L.
Các kết quả nghiên cứu đã cho thấy, mặc dù hàm lượng lipit và squalene của chủng Thraustochytrium striatum cao hơn các loài VTB quang tự dưỡng khác nhưng khả năng tạo sinh khối thấp hơn rất nhiều so với chủng PQ6 (100-120 g sinh khối tươi/L). Chính vì vậy, chúng tôi đã lựa chọn nghiên cứu tách chiết và làm sach squalene từ loài S. mangrovei PQ6 để tìm kiếm chủng tiềm năng cho sản xuất squalene sau này.
3.2.4. Xác định hàm lƣợng squalene trong sinh khối bình lên men 30 lít bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng cao áp
3.2.4. 1. Tách chiết lipit không xà phòng hóa từ lipit tổng số
Squalene là một thành phần trong lipit không xà phòng hóa của vi tảo. Việc phân tách lipit không xà phòng hóa từ lipit tổng số nhằm mục đích nâng cao hàm lượng squalene và giảm sự phức tạp trong thành phần của mẫu lipit dùng cho phân tích sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng cao áp. Hình 3.9 là hình minh họa cho quá trình phân tách lipit không xà phòng hóa từ lipit tổng số.
Hình 3.9. Ảnh minh họa cho quá trình phân tách lipit không xà phòng hóa từ lipit tổng số
3.2.4.2. Xác định squalene bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng cao áp
Các phương pháp sắc ký cho phép phân tách, tinh sạch và định lượng squalene với độ chính xác cao. Kết quả chỉ ra trên hình 3.10 cho thấy mẫu lipit không xà phòng hóa tách chiết từ sinh khối PQ6 có xuất hiện băng tương đồng với băng squalene chuẩn. Đồng thời, phần silicagel có chứa các băng này tiếp tục được sử dụng để phân tích trên sắc ký lỏng cao áp.
Hỗn hợp trước phản ứng
Hỗn hợp phản ứng ở 600C trong 3 giờ
Hỗn hợp sau phản ứng
Thu hồi lớp trên có chứa
Hình 3.10. Sắc ký lớp mỏng mẫu lipit không xà phòng hóa tách chiết từ sinh khối chủng PQ6 (giếng 1: squalene chuẩn - 2 mg; giếng 2, 3, 4: lipit không xà
phòng hóa tách từ sinh khối chủng PQ6)
Squalene được phân tích bằng sắc ký lỏng cao áp với cột sắc ký lỏng Thermo Hypersild Gold C18 (150 x 2,1 mm, 3 µm), pha động là dung dịch acetonitrile : nước (9:1, v/v), tốc độ dòng 250 µL/min. Sự nhận dạng squalene được thực hiện bằng cách sử dụng đầu dò PDA Accella với khoảng quét 190-400 nm, bước sóng UV đặt ở 198 nm và thời gian lưu của mẫu có chứa squalene được so sánh với thời gian lưu của squalene chuẩn (C30H50, Sigma S3626). Hàm lượng squalene trong mẫu được xác định dựa trên đường chuẩn về mối tương quan giữa nồng độ của squalene chuẩn với diện tích peak tương ứng. Hình 3.11 là đường chuẩn về mối tương quan giữa hàm lượng squalene và diện tích peak được phân tích bằng HPLC. Hình 3.12 và 3.13 là sắc kí đồ của squalene chuẩn và squalene có trong sinh khối tảo.
Squalene
Hình 3.11. Đƣờng chuẩn về mối tƣơng quan giữa hàm lƣợng squalene và diện tích peak
Hình 3.12. Sắc ký đồ của squalene chuẩn xác định bằng sắc ký lớp mỏng TLC và HPLC squalene Y = 378037+432055*X R^2 = 0.9992 W: Equal 0 10 20 30 40 ppm 0 5000000 10000000 15000000 20000000 A re a
Hình 3.13. Sắc ký đồ của mẫu PQ6 squalene đƣợc phân tách bằng sắc ký lớp mỏng và xác định bằng HPLC
Chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng squalene của chủng PQ6 bằng phương pháp TLC và HPLC. Kết quả nghiên cứu thu được được chỉ ra trên bảng 3.4.
Bảng 3.4. Hàm lượng squalene của chủng PQ6 được phân tích bằng TLC và HPLC
Squalene Hàm lượng (mg/g)
Squalene tính theo lipit không xà phòng hóa 828,351 Squalene tính theo lipit tổng số 65,597 Squalene tính theo sinh khối khô 33,134
Kết quả cho thấy các điều kiện cho chạy sắc ký lỏng cao áp là phù hợp để phân tách và xác định squalene từ lipit không xà phòng hóa của chủng PQ6. Trên sắc ký đồ của mẫu silicagel đem phân tích có peak bằng thời gian lưu của squalene chuẩn. Hàm lượng squalene của S. mangrovei PQ6 sau khi phân tách bằng TLC và định lượng bằng HPLC là 33,134 mg/g sinh khối khô (bảng 3.4), thấp hơn so với giá trị tính toán được theo phương pháp so màu. Điều này được giải thích là do sự thất thoát của squalene sau các bước tách chiết và tinh sạch. Ngoài ra, trong phương pháp so màu, bên cạnh squalene thì các thành phần khác của lipit như lanosterol hoặc ergosterol cũng cho phản ứng màu dương tính, vì vậy, kết quả tính toán được
có thể bao gồm cả squalene và sterol khác [10]. Với hàm lượng squalene là 33,134 mg/g SKK, chủng PQ6 có sản lượng squalene đạt 0,992 g/L khi được nuôi trồng ở bình lên men 30 Lít.
3.2.4.3. Sử dụng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC) - bản nhỏ để sàng lọc nhanh chóng các chủng vi tảo biển chứa hàm lượng squalene cao nhanh chóng các chủng vi tảo biển chứa hàm lượng squalene cao
Sau khi đã làm chủ được phương pháp chạy sắc ký bản mỏng để phân tách tốt đối với squalene, cùng với các phương pháp sàng lọc nhanh khác đã được trình bầy ở phần trên, chúng tôi đã tiến hành sử dụng phương pháp TLC (bản kẽm, có diện tích nhỏ) để sàng lọc nhanh chóng các chủng vi tảo có hàm lượng squalene cao nhằm so sánh độ chính xác, khả năng áp dụng (có tính khả thi cao, tiết kiệm thời gian hay không) với các phương pháp khác (so màu).
Kết qủa sử dụng phương pháp TLC để xác định sơ bộ hàm lượng squalene đối với một số chủng VTB quang tự dưỡng và dị dưỡng được chỉ ra trên hình 3.14.
Hình 3.14. Áp dụng phƣơng pháp TLC (bản nhôm, bản nhỏ) để sàng lọc nhanh các chủng vi tảo biển có hàm lƣợng squalene cao. Đƣờng 0- saqualene chuẩn;
1- Schizochytrium limacinum PQ7; 2, 3, 4 – S. mangrovei PQ6; 5- Thraustochytrium striatum; 6 – Thraustochytrium stiatum TH16; 7- T. striatum ND3; 8 – I. galbana; 9 – D. tertiolecta; 10 – C. vulgaris; 11 – T. convolutae; 12 –
So sánh kết quả chỉ ra trên hình 3.14 và kết quả đã được chỉ ra trên bảng 6 đã cho thấy chủng PQ6 vẫn là chủng có hàm lượng squalene cao nhất sau đến các chủng khác theo thứ tự > S. limacinum PQ7> Thraustochytrium striatum >
Thraustochytrium striatum TB17> T. striatum ND3> I. galbana> D. tertiolecta> C. vulgaris> Tetraselmis convolutae> Nannochloropsis oculata. Các kết quả chỉ ra trên hình 3.14 về cơ bản trùng với kết quả chỉ ra trên bảng 3.3. Như vậy, sau này có thể sử dụng phương pháp TLC (bản kẽm, diện tích nhỏ) có sử dụng chất chuẩn để sàng lọc nhanh các chủng VTB có hàm lượng squalene cao cùng với việc xác định hàm lượng squalene bằng phương pháp so màu (một phương pháp có độ chính xác không được cao như đã phân tích ở phần nêu trên).
3.3. Tinh sạch squalene bằng phƣơng pháp sắc kí cột
3.3.1. Xác định squalene bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng
Phương pháp sắc ký lớp mỏng được dùng để định tính, thử tinh khiết và đôi khi để bán định lượng hoặc định lượng hoạt chất thuốc. Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó