nhanh chóng các chủng vi tảo biển chứa hàm lượng squalene cao
Sau khi đã làm chủ được phương pháp chạy sắc ký bản mỏng để phân tách tốt đối với squalene, cùng với các phương pháp sàng lọc nhanh khác đã được trình bầy ở phần trên, chúng tôi đã tiến hành sử dụng phương pháp TLC (bản kẽm, có diện tích nhỏ) để sàng lọc nhanh chóng các chủng vi tảo có hàm lượng squalene cao nhằm so sánh độ chính xác, khả năng áp dụng (có tính khả thi cao, tiết kiệm thời gian hay không) với các phương pháp khác (so màu).
Kết qủa sử dụng phương pháp TLC để xác định sơ bộ hàm lượng squalene đối với một số chủng VTB quang tự dưỡng và dị dưỡng được chỉ ra trên hình 3.14.
Hình 3.14. Áp dụng phƣơng pháp TLC (bản nhôm, bản nhỏ) để sàng lọc nhanh các chủng vi tảo biển có hàm lƣợng squalene cao. Đƣờng 0- saqualene chuẩn;
1- Schizochytrium limacinum PQ7; 2, 3, 4 – S. mangrovei PQ6; 5- Thraustochytrium striatum; 6 – Thraustochytrium stiatum TH16; 7- T. striatum ND3; 8 – I. galbana; 9 – D. tertiolecta; 10 – C. vulgaris; 11 – T. convolutae; 12 –
So sánh kết quả chỉ ra trên hình 3.14 và kết quả đã được chỉ ra trên bảng 6 đã cho thấy chủng PQ6 vẫn là chủng có hàm lượng squalene cao nhất sau đến các chủng khác theo thứ tự > S. limacinum PQ7> Thraustochytrium striatum >
Thraustochytrium striatum TB17> T. striatum ND3> I. galbana> D. tertiolecta> C. vulgaris> Tetraselmis convolutae> Nannochloropsis oculata. Các kết quả chỉ ra trên hình 3.14 về cơ bản trùng với kết quả chỉ ra trên bảng 3.3. Như vậy, sau này có thể sử dụng phương pháp TLC (bản kẽm, diện tích nhỏ) có sử dụng chất chuẩn để sàng lọc nhanh các chủng VTB có hàm lượng squalene cao cùng với việc xác định hàm lượng squalene bằng phương pháp so màu (một phương pháp có độ chính xác không được cao như đã phân tích ở phần nêu trên).
3.3. Tinh sạch squalene bằng phƣơng pháp sắc kí cột
3.3.1. Xác định squalene bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng
Phương pháp sắc ký lớp mỏng được dùng để định tính, thử tinh khiết và đôi khi để bán định lượng hoặc định lượng hoạt chất thuốc. Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách.
Dung môi thích hợp dùng trong pha động sẽ là một hệ dung môi có tính phân cực khác với pha tĩnh. Nếu một dung môi phân cực được dùng để hòa tan mẫu thử trên một pha tĩnh phân cực, hỗn hợp mẫu thử sẽ lan tròn do mao dẫn, và các chất khác nhau có thể bị lẫn vào nhau. Do đó, để hạn chế sự lan tròn của hỗn hợp mẫu thử, dung môi được sử dụng để hòa tan mẫu thử phải không phân cực, hoặc phân cực một phần, nếu pha tĩnh phân cực, và ngược lại. Nhằm mục đích xác định, thử độ tinh khiết và để bán định lượng squalene chúng tôi lựa chọn các hệ dung môi cho chạy sắc ký lớp mỏng là hexan/diethyleter/acetic acid (70: 30: 4, v/v/v), dichlomethane/methanol (96:4, v/v), chloroform/methanol (9:1, v/v), n- hexan/chloroform (4:1, v/v) và n-hexan. Kết quả trên hình 3.15. cho thấy dung môi n-hexan đã cho phép xác định được sự có mặt squalene với 1 băng duy nhất và có giá trị Rf = 0,55. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn n-hexan như là dung môi tối ưu cho chạy sắc ký lớp mỏng ở các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.15. Sắc ký lớp mỏng xác định squalene từ mẫu chuẩn và mẫu lipit không xà phòng hóa của chủng PQ6 với các hệ dung môi chạy khác nhau.
(A) hệ dung môi hexan/diethyleter/acetic acid (70: 30: 4, v/v/v), (B) hệ dung môi dichlomethane/methanol (96:4, v/v), (C) hệ dung môi chloroform/methanol (9:1, v/v), (D) hệ dung môi n-hexan/chloroform (4:1, v/v) và (E) dung môi n-hexan. Trong đó 1:
squalene chuẩn, 2 và 3 là mẫu lipit không xà phòng hóa tách từ chủng PQ6.
3.3.2. Phân tách và tinh sạch squalene bằng sắc ký cột silicagel
Lipit không xà phòng hóa được tách chiết từ sinh khối chủng PQ6 chiếm 4% sinh khối khô (4 mg/g). Squalene trong lipit không xà phòng hóa được tiến hành tinh sạch sơ bộ bằng cách lọc và rửa với dung môi n-hexan. Sau đó sản phẩm squalene thu được sau khi tinh sạch sơ bộ tiếp tục được làm sạch bằng cột sắc ký silicagel. Trong phương pháp sắc ký cột silica gel, cột thủy tinh được nạp chất hấp phụ là silicagel 60 (0,06-0,2 mm) đến 2/3 thể tích. Cột được rửa với dung môi nền là n-hexane trong 1 giờ nhằm ổn định cấu trúc. Mẫu được nạp lên cột và thôi mẫu bằng dung môi n-hexane. Hình 3.16 là hình minh họa cho quá trình tinh sạch bằng sắc ký cột silica gel. Squalene thu được sau khi tiến hành tinh sạch bằng cột sắc kí silicagel được kiểm tra độ sạch và xác định hàm lượng bằng TLC và HPLC (Hình 3.17.). Kết quả trên hình 3.17 cho thấy, squalene tinh sạch chỉ có 1 băng duy nhất và tương đồng với băng squalene chuẩn. Do đó, chúng tôi kết luận rằng squalene của chủng PQ6 sau khi tinh sạch qua cột silicagel có độ tinh khiết cao và có thể so sánh được với squalene chuẩn của hãng Sigma (độ tinh khiết > 98%).
Hình 3.17. Sắc ký lớp mỏng (A) và sắc ký đồ (B) của mẫu squalene từ chủng PQ6 sau khi tinh sạch qua cột silicagel.
(A): Sắc ký lớp mỏng (TLC) của mẫu squalene chuẩn (đường 1) và mẫu squalene từ chủng PQ6 sau khi tinh sạch qua cột silicagel (đường 2 đến 4). (B): Sắc ký đồ HPLC của mẫu squalene chuẩn và mẫu squalene được tách chiết từ chủng PQ6 sau khi tinh sạch qua sắc ký cột.
3.4. Quy trình tách chiết squalene từ sinh khối tảo dị dƣỡng S. mangrovei PQ6
Quá trình tách chiết squalene tinh sạch từ sinh khối VTB dị dưỡng S. mangrovei PQ6 được tiến hành gồm các bước: tách chiết lipit tổng số từ sinh khối chủng PQ6; tách chiết squalene thô từ lipit tổng số; tinh sạch squalene từ squalene thô. Trong đó, squalene thô hoặc squalene đã tinh sạch đều được kiểm tra sơ bộ hàm lượng bằng so mầu và sắc ký bản mỏng TLC và HPLC.
Qua rất nhiều thí nghiệm, chúng tôi đã thu được quy trình tách chiết squalene từ sinh khối VTB dị dưỡng S. mangrovei PQ6 được trình bày ở hình 3.18; 3.19; 3.20 như sau:
Hình 3.18. Tách lipit tổng số từ sinh khối chủng PQ6
Li tâm hôn hợp 4000 vòng/phút, trong 10 phút, lọc qua giấy lọc
Ө11
Ngâm chiết trên máy khuấy từ qua đêm, khuấy liên tục, 13h
Li tâm hỗn hợp 4000 vòng/phút, trong 10 phút, lọc qua giấy lọc Ө11 Cất quay 700C Thu lớp trên Bã sinh khối Bổ sung 1200ml hỗn hợp dd hóa chất methanol: chloroform tỉ lệ 2:1 (v/v) 80g SKK Hỗn hợp Lipit tổng số Thu lớp trên Bã sinh khối Làm bay hơi Methanol, chloroform Rửa 3 lần Bã sinh khối Bổ sung 200ml hỗn hợp dd hóa chất methanol: chloroform tỉ lệ 2:1 (v/v)
Hình 3.19 Tách squalene thô từ lipit tổng số của chủng PQ6
Thu lớp trên vòng/phút, trong 10 phút Li tâm hôn hợp 4000
Bã sinh khối Bổ sung 400ml hh dd hóa chất methanol: acetone tỉ lệ 7:3 (v/v), vontex hỗn hợp trong 5 phút Để hỗn hợp trong tủ - 200 C, trong 40h, thấy phân thành 2 lớp Lipit tổng số Hỗn hợp Li tâm hôn hợp 4000 vòng/phút, trong 10 phút Thu lớp trên Bã sinh khối Rửa 3 lần Bã sinh khối Bổ sung 100ml hỗn hợp dung dịch hóa chất methanol: aceton tỉ
lệ 7:3 (v/v) lạnh Cất quay 700C Squalene thô Làm bay hơi Methanol, aceton
Hình 3.20. Tinh sạch squalene thô từ lipit tổng số
Một số nguyên nhân được đưa ra để giải thích cho sự chênh lệch về hàm lượng squalene của sinh khối chủng S. mangrovei PQ6 theo phương pháp so màu so với phương pháp TLC, HPLC như sau: Ở phương pháp chạy sắc kí cần phải đi qua bước phân tách thành lipit không xà phòng hóa từ lipit tổng số. Sau đó mẫu lipit không xà phòng hóa mới được sử dụng để chạy TLC nhằm tách squalene ra khỏi các thành phần khác của lipit, phần silicagel chứa squalene lúc này được sử dụng để xác định hàm lượng bằng HPLC. Sau nhiều bước tách chiết và tinh sạch như vậy không tránh khỏi sự thất thoát dẫn đến việc giảm hàm lượng squalene. Trong khi đó, ở phương pháp so màu, bên cạnh squalene thì các thành phần khác của lipit như lanosterol hoặc ergosterol cũng cho phản ứng màu dương tính, vì
Bổ sung 200ml hexane: methanol tỉ lệ 2:1 (v/v), vontex hh trong 5 phút hợp trong 5 phút Để lắng hỗn hợp trong 10phút, thấy phân thành 2 lớp 5g squalene thô Hỗn hợp
Lớp dƣới Lớp trên Voltex, để lắng hỗn
hợp trong 10 phút, thấy phân thành 2
lớp Voltex, để lắng hỗn hợp
trong 10 phút, thấy phân thành 2 lớp Lớp dƣới Lớp dƣới Lớp trên Lớp trên Lặp lại 3 lần Phân tích squalene bằng phương pháp TLC và HPLC Lớp dưới là methanol chứa ít squalene Lớp trên là hexen chứa nhiều squalene Phân tích squalene bằng phương pháp TLC và HPLC
vậy, kết quả tính toán được có thể bao gồm cả squalene và sterol khác (Bhattacharjee et al., 2001) (10) nên hàm lượng squalene xác định được theo phương pháp so màu sẽ là cao hơn so với giá trị thực có về squalene được xác định bằng các phương pháp khác.
Nakazawa et al., (2012) [64] cũng đã xác định hàm lượng squalene trong một số chủng tảo bằng phương pháp TLC kết hợp sắc ký khí (GC), tương tự như phương pháp của chúng tôi. Kết quả nghiên cứu cho thấy, hàm lượng squalene của 3 chủng Aurantiochytrium limacinum 9F-4a, 4W-1b, 18W-13a và chủng
Schizochytrium limacinum SR21 đạt 0,6; 0,5; 171,1 và 0,2 mg/g SKK, tương ứng. Cũng theo một công bố của Yue và Jiang (2009) thì hàm lượng squalene đạt 1,17 mg/g sinh khối khô tảo sau 3 giờ bổ sung methyl jasmonate (MJA) ở thời điểm 48 giờ nuôi đối với chủng S. mangrovei [96]. Như vậy, hàm lượng squalene của chủng
S. mangrovei trong nghiên cứu của chúng tôi (33,134 mg/g SKK) là cao hơn so với chủng do Yue và Jiang (2009) công bố. Dựa trên các kết quả nghiên cứu của các tác giả nêu trên đã cho thấy quá trình sinh tổng hợp squalene có thể được tăng cường bằng việc tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy như là nhiệt độ, nồng độ glucose, tuổi tế bào hoăc dưới điều kiện có bổ sung một số chất ức chế quá trình tổng hợp squalene như MJA, terbinafine (TBNF) lên sinh trưởng và tích lũy squalene ở các chủng VTB khác nhau.
Vì vậy, để có thể sản xuất squalene từ chủng S. mangrovei PQ6 chúng tôi cần phải có những nghiên cứu tiếp tục theo hướng tối ưu hóa các điều kiện nuôi trồng chúng như là ảnh hưởng nhiệt độ, nồng độ glucose và thời gian nuôi cấy cũng như ảnh hưởng của một số chất ức chế tổng hợp squalene như methyl jasmonate, terbinafine… lên sinh trưởng và tích lũy squalene ở chủng PQ6 để thu sinh khối tảo cao, vừa có khả năng sản xuất squalene cao trong quy mô bình lên men 30 lít và 150 lít. Do vậy, những nghiên cứu nhằm nâng cao hàm lượng squalene trong sinh khối loài vi tảo này là cần thiết và sẽ được chúng tôi công bố trong những công trình tiếp theo.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
Qua các kết quả nghiên cứu được trình bày ở phần trên, chúng tôi xin rút ra một số kết luận như sau:
- Lựa chọn được phương pháp so màu nhanh, rẻ tiền để xác định hàm lượng squalene trong sinh khối tảo trong điều kiện Việt Nam; hàm lượng squalene của 5 chủng vi tảo biển quang tự dưỡng gồm Nannochloropsis oculata, Chlorella vulgaris, Tetraselmis convolutae, Isochrysis galbana, Dunaliella teriolecta và 2 loài dị dưỡng (Thraustochytrium striatum và Schizochytrium mangrovei) dao động từ 0,193-122 mg/g sinh khối khô;
- Chọn được một loài vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 trong tập đoàn giống của phòng Công nghệ Tảo có tiềm năng cho việc sản xuất lượng lớn squalene (122 mg/g sinh khối khô xác định theo phương pháp so màu);
- Có được phương pháp sàng lọc nhanh chủng tiềm năng cho sản xuất squalene bằng phương pháp so màu và sắc ký bản mỏng TLC với kích thước nhỏ có sử dụng chất chuẩn.
- Đã tiến hành phân tách, làm sạch và xác định hàm lượng squalene trong thành phần lipit không xà phòng hóa của sinh khối chủng PQ6 bằng phương pháp sắc kí bản mỏng và sắc kí lỏng cao áp.
- Hàm lượng squalene xác định theo TLC và HPLC của chủng PQ6 đạt 33,134 mg/g sinh khối khô và sản lượng squalene đạt 0,992 g/L khi được nuôi trồng ở bình lên men 30 Lít.
KIẾN NGHỊ
Từ các kết quả nghiên cứu đã thu được chúng tôi xin có một số kiến nghị cho các nghiên cứu tiếp theo như sau:
Cần tiếp tục nghiên cứu điều kiện nuôi trồng tối ưu cho thu nhận sinh khối chủng S. mangrovei PQ6 có sinh khối cao và hàm lượng squalene cao như: ảnh hưởng của nồng độ glucose; nhiệt độ; thời gian nuôi cấy; tuổi tế bào và có mặt một số chất ức chế tổng hợp squalene…
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Đặng Diễm Hồng và cs., (2011). Báo cáo tổng kết đề tài “Xây dựng tập đoàn giống vi tảo biển quang tự dưỡng, dị dưỡng của Việt Nam và nuôi sinh khối một số loài tảo dị dưỡng làm thức ăn trong nuôi trồng thủy sản” đề tài cấp Nhà nước thuộc chương trình Công nghệ sinh học trong nuôi trồng thủy sản năm 2008-2010 do Bộ NN-PTNT quản lý
2. Hoàng Lan Anh, Đinh Thị Thu Hằng, Đặng Diễm Hồng., (2009). Đánh giá hiệu quả sử dụng sinh khối vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 trong việc làm giàu Luân trùng (Brachionus plicatilis) và Artemia nauplii. Tuyển tập Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh học biển và phát triển bền vững. Nhà xuất bản KHTN và CN, Hà Nội, 27-28/11/2009. Trang 413-421.
3. Hoang Thi Lan Anh., (2014). Luận án Tiến sỹ sinh học. 150 trang
4. Ngô Thị Hoài Thu, Hoàng Thị Lan Anh, Đặng Diễm Hồng., (2010). Đánh giá hiệu quả sử dụng sinh khối vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei
PQ6 làm thức ăn cho tu hài (Lutraria rhynchaena Jonas, 1844). Tạp chí sinh học. 32(4): 83-88
Tiếng Anh
5. Ab Gapor M.D., Top., Leong L.W., Ong A.S.H., Kawada T., Watanabe H., Tsuchiya N., (1999). Production of high concentration tocopherols and tocotrienols from palm oil by-products. Malaysian patent No. my-11079-A
6. Aki T., Hachida K., Yoshinaga M., Katai Y., Yamasaki T., Kawamoto S., Kakizono T., Maoka T., Shigeta S., Suzuki O., Ono K. (2003).
Thraustochytrids as a potential source of carotenoids. J Am Oil Chem Soc. 80: 789-794
7. Alvaro L. Ronco., Eduardo De Stéfani., (2013). Squalene: a multi-task link in the crossroads of cancer and aging, Functional Foods in Health and Disease, 3(12): 462-476
8. Barnett G., (1972). Emollient creams and lotions. In comestic, Science and Techno-logy (Balsam, M S and Sagaran, E eds.). Second edition, Vol.1. Wiley-Interscience, p.27-104.
9. Beanerjee A, Sharma R., Chisti Y., Banerjee U.C., (2002). Botryococcus braunii - A renewable source of hydrocacbons and other chemicals. Crit. Rev. Biotechnol. 22: 245-279.
10. Bhattacharjee P., Shukla V.B., Singhal R.S., and Kulkarni P.R., (2001).
Studies on fermentative production of squalene. World Journal of Microbiology & Biotechnology. 17: 811-816
11. Bhattacharjee P., R.S. Singhal., (2003). Extraction of squalene from yeast by supercritical carbon dioxide. World Journal of Microbiology & Biotechnology.
19: 605–608.
12. Blasco. L., Duracher. L.., Forestier J.P., (2006). Skin constituents as cosmetic ingredients: part I: a study of bio-mimetic monoglycerides behavior at the squalene-water interface by the "pendant drop"method in a static mode.
J. Dispers. Sci. Technol. 27: 799-810.
13. Bligh E.G., Dyer W.J., (1959) A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37: 911-917
14. Bordier C.G., Sellier N., Foucault A.P., Goffic F.L., Le, Goffic F., (1996)
Purification and characterization of deep sea shark Centrophorus squamosusliver oil 1-O- alkylglycerol ether lipids. Lipids. 31 (5): 521-528.
15. Busquets A., Kein V., Closa M., del Arco A., Boronat A., Arro M., Ferrer A., (2008). Arabidopsis thaliana contain a single gene encoding squalene synthase. Plant Mol Biol, 67: 25-36
16. Chang M.H., Kim H.J., Jahng K.Y., Hong S.C., (2008). The isolation and chacracteration of Pseudozyma sp. JCC 207, a novel producer of squalene.
Appl Microbiol Biotechnol. 78: 963-972
17. Chen F., (1996). High cell density culture of microalge in hetero-trophic growth. Trends Biotechnol. 14: 421-426
Optimization of nitrogen source for enhanced production of squalene from thraustochytrids Aurantiochytrium sp. N. Biotechnol, 27(4): 382-9.
19. Christian M., (1982). Final report on the safety assessment of squalane and squalene. J Am Coll Toxicol, 1 (2): 37–56.
20. Cooksey K.E., Guckert J.B., Williams S.A., Callis P.R., (1987).