Các thiết bi và dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu gồm: Buồng đếm Burker - Turk (Đức); Máy ảnh kỹ thuật số Canon IXY Digital 70 (Nhật Bản); Kính hiển vi quang học Olympus CX21 (Nhật Bản); Cân kỹ thuật Precisa XB 1200C; Cân phân tích Shimazu AY120 (Nhật Bản); Máy li tâm Sorvall RT 1900 W (Kendo, Đức), Máy khử trùng (Nhật Bản); Tủ cấy vô trùng Holten laminAir HH48 (Mỹ); Tủ nuôi cấy 280C BINDER (Đức); Máy khuấy từ Kika Labortechnik (Đức); pH kế Melter Toledo (Đức); Máy đo mật độ quang học UV-1601 Shimazu (Nhật Bản); Tủ sấy Cornthem (New Zealand); Máy lắc IKA KS 26
ng (NIKON eclipse 80i- ); desiccator; máy đo cường độ ánh sáng (Lux meter,
Nga); các loại bình tam giác từ loại 100, 250, 500,1000 mL…đều được sử dụng cho nuôi tảo (Trung Quốc); ống đong các loại; bếp điện; bể ổn nhiệt; phễu chiết; cối- chày sứ; đĩa pettri, ống nghiệm nút xoáy; lọ penicillin; giấy lọc GF/C (What man) và các dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm.
2.2. Phƣơng pháp
2.2.1. Xác định sinh trƣởng qua mật độ tế bào
Xác định sinh trưởng của các chủng vi tảo biển bằng mật độ tế bào (MĐTB) tảo bằng buồng đếm hồng cầu Burker-Turk (Đức): Lắc đều dịch tảo cần xác định MĐTB. Lấy 40µL dịch tảo chia đều vào mỗi buồng đếm, đậy lamen nghiêng góc 45º so với buồng đếm, sau đó đặt lamen xuống từ từ để tránh tạo ra bọt khí.
Điều chỉnh tiêu cự của kính hiển vi quang học và tiến hành quan sát ở vật kính 10X để tìm được buồng đếm trên kính trường, sau đó quan sát ở vật kính 40X. Tiến hành đếm trên cả 16 ô lớn trong buồng đếm, chú ý khi đếm phải qui ước cạnh được đếm trên ô vuông lớn để đếm chính xác hơn. Số lần đếm được lặp lại khoảng 6 đến 8 lần.
- Mật độ tế bào được tính theo công thức:
D = A * X * 104
Trong đó: D: Mật độ tế bào (TB/mL)
A: Tổng số tế bào trong cả buồng đếm; X: Hệ số pha loãng
(Chú ý: đối với các mẫu tảo có khả năng di động, trước khi đếm mẫu phải cố định bằng dung dịch 98% Ethanol hoặc 4% Focmon).
2.2.2. Xác định hình thái và kích thƣớc tế bào bằng kính hiển vi quang học
Hình thái tế bào được chụp bằng máy ảnh kỹ thuật số Canon IXY 7.0 của Nhật Bản dưới kính hiển vi quang học Olympus CX21 ở độ phóng đại 400 lần và độ phóng đại của máy ảnh 3 lần.
Kích thước tế bào được đo bằng phần mềm MapInfo Professional 7.5: Sử dụng thước chuẩn để chụp ảnh chuẩn và tiến hành chụp ảnh tế bào cùng độ phóng đại với ảnh chuẩn sau đó chuyển ảnh vào máy tính và sử dụng công cụ đo khoảng
cách trong phần mềm để xác định kích thước tế bào, công thức xác định kích thước tế bào như sau:
KT tb (ft): kích thước tế bào đo được trên ảnh bằng phần mềm;
KT tc (ft): kích thước đo được trên ảnh của đoạn thước chuẩn kích thước thực tế là 25 µm.
2.2.3. Xác định sinh trƣởng qua sinh khối khô
Cách 1: Sinh khối khô tảo (SKK, g/L) được tính theo phương pháp sấy khô mẫu ở 800C:
Bƣớc 1: Sấy cốc cân ở 1050C trong 3 giờ. Lấy cốc ra để nguội trong desiccator (trong 30 phút). Cân khối lượng cốc và lặp lại cho đến khối lượng cốc không đổi, được m1 (g).
Bƣớc 2: Lấy10mL dịch tảo cho vào cốc đã sấy ở bước 1 và sấy ở 800C trong 24 giờ. Lấy ra để nguội trong desiccator (30 phút), cân khối lượng cốc và sinh khối. Lặp lại quá trình sấy đến khối lượng không đổi được m2 (g). Tiến hành tương tự với 10mL môi trường nuôi (không có tảo) được m3 (g).
Bƣớc 3: Tính sinh khối khô của tảo theo công thức sau:
SKK (g/l) = 1000 10 ) m - (m - ) m - (m2 1 3 1 x
Trong đó: (m2 – m1) là khối lượng khô của (sinh khối tảo + môi trường); (m3 – m1) là khối lượng khô của môi trường.
2.2.4. Phƣơng pháp nhuộn lipid bằng Nile red [44]
(9-(Diethylamino)-5H benzo [α - - (NIKON eclipse 80i- KT tb (ft) x 25 (µm) Kích thước tế bào (µm) = KT tc (ft)
450–490 nm và ánh sáng phát huỳnh quang của Nile Red ở bước sóng 540-640 nm.
2.2.5. Tách chiết lipit
Sinh khối tảo quang tự dưỡng và dị dưỡng sử dụng cho tách chiết lipit và xác định hàm lượng squalene được thu hoạch ở thời điểm trước pha cân bằng và sinh khối tảo dị dưỡng được thu hoạch sau 4 ngày
(1959) [13] [1] 0,5 gam Na2SO4 – - 600 - .
2.2.6. Định lƣợng squalene bằng phƣơng pháp so màu [79]
1 mL axit sulfuric đậm đặc được bổ sung vào ống nghiệm chứa lipit và ống thí nghiệm được đặt trong bể ổn nhiệt ở 700C trong 5 phút. Sau giai đoạn giữ ấm, tiến hành bổ sung từ từ 0,5 mL dung dịch formaldehyde và lắc đều ống chứa mẫu. Sau đó, ống chứa mẫu được đậy nắp và đặt trong nước sôi trong 10 phút. Ngay sau khi đưa mẫu khỏi bể ổn nhiệt, bổ sung 2,5 mL axit acetic lạnh để đưa thể tích mẫu
lên 4 mL, trộn đều hỗn hợp và tiến hành xác định mật độ quang ở bước sóng 400 nm bằng máy quang phổ (Hitachi U-1100 Spectrophotometer, Nhật Bản). Hàm lượng squalene trong mẫu được xác định dựa trên giá trị OD tại bước sóng 400 nm thu được và đường chuẩn về tương quan giữa hàm lượng squalene chuẩn (C30H50, Sigma S3626) với giá trị mật độ quang đo được ở bước sóng 400 nm tương ứng.
2.2.7. Tách chiết và tinh sạch squalene thô [59]
2.2.7.1. Tách chiết squalene thô
Cân 8 g SKK (đã được nghiền khô mịn bằng máy xay sinh tố) cho vào chai pyrex 500mL. Bổ sung 120mL hỗn hợp dung dịch hóa chất methanol: chloroform tỉ lệ 2:1 (v/v), ngâm chiết trên máy khuấy từ qua đêm (máy khuấy từ đặt trong phòng box, bật điều hòa 270C, đặt tốc độ khuấy ở mức 3, khoảng 13h khuấy liên tục). Lấy mẫu ra khỏi máy khuấy từ, để phân lớp tự nhiên 30-45 phút. Hút phần dịch trong phía trên cho riêng vào 2 ống fancol, phần bã sinh khối phía dưới cho vào 2 ống fancol. Cả 4 ống li tâm 4000 vòng/phút, trong 10 phút. Sau li tâm, hút phần dịch trong phía trên của 2 ống dịch phần trên cho vào bình cầu 250mL, hút phần dịch trong phía trên của 2 ống chứa bã sinh khối lọc qua giấy lọc Ө 11 trên phễu thủy tinh. Rửa sinh khối 3 lần, mỗi lần bổ sung 20mL hỗn hợp dung dịch hóa chất methanol: chloroform tỉ lệ 2:1 (v/v) để rửa bã sinh khối. Li tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút. Hỗn hợp phân thành 2 lớp, hút lớp trên lọc qua giấy lọc Ө 11. Toàn bộ phần dịch trên tiến hành cất quay (nhiệt độ 700C, trong 15-20 phút) để loại bỏ hết dung môi và thu lipid tổng số.
Toàn bộ lipit tổng số thu được, bổ sung 40mL hỗn hợp dung dịch hóa chất methanol: acetone tỉ lệ 7:3 (v/v), vontex hỗn hợp trong 5 phút thấy có phân lớp chưa rõ ràng. Để hỗn hợp trong tủ - 200C, trong 40h, thấy phân thành 2 lớp. Lấy phần trên lọc qua giấy lọc GF/C, phần dưới tiến hành li tâm 6000 vòng/ phút trong 5 phút, thấy phân thành 2 lớp, lấy lớp trên. Rửa lớp dưới 3 lần, mỗi lần bổ sung 10mL hỗn hợp dung dịch hóa chất methanol:acetone tỉ lệ 7:3 (v/v) lạnh -200C, để rửa phần dưới, lắc đều, li tâm 6000 vòng/ phút trong 5 phút. Hỗn hợp phân thành 2 lớp, thu lớp trên. Toàn bộ phần dịch trên tiến hành cất quay (nhiệt độ 700
C, trong 15-20 phút) để loại bỏ hết dung môi và thu squalene thô.
2.2.7.2. Tinh sạch squalene thô
Cân 10,8mg squalene thô vào trong ống fancol 50ml. Bổ sung 20mL n- hexane: methanol tỉ lệ 2:1 (v/v), (chú ý lắc đều hỗn hợp dung môi trên trước khi đổ ra ống đong, vì 2 dung môi này có sự phân lớp), vontex mạnh trong 5 phút, để lắng 10 phút, thấy có sự phân thành 2 lớp: lớp methanol phía dưới chứa squlene với lượng ít, lớp n-hexane trên chứa nhiều squalene. Hút lớp trên ra ống fancol 50mL, lớp dưới ra ống fancol 15mL mới (để cho dễ phân lớp vì lớp này ít), vontex mạnh trong 5 phút, để lắng 10 phút, thấy có sự phân thành 2 lớp. Hút 2 lớp trên của 2 ống trên vào 1 ống fancol mới. Hút 2 lớp dưới của 2 ống trên vào một ống fancol mới. Bước này lặp lại 3 lần, ta có 1 ống fancol chứa lớp trên và 1 ống fancol chứa lớp dưới. Li tâm 4000 vòng/phút, trong 15 phút. Hút lớp trên ở cả 2 ống và định lượng thể tích (V) thu được ( lớp n-hexane chứa phần lớn squalene). Hút lớp dưới ở cả 2 ống và định lượng lại thể tích thu được (lớp methanol chứa ít squlene).
2.2.8. Xác định hàm lƣợng squalene bằng phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng
- Phân tách lipit không xà phòng hoá từ lipit tổng số [55]:
Lipit tổng số được cho phản ứng với dung dịch KOH 5% (khối lượng/thể tích) trong metanol-nước (4:1, thể tích/thể tích) ở 600C trong 3 giờ. Sau phản ứng, hỗn hợp được làm nguội đến nhiệt độ phòng và bổ sung thêm 4 mL nước cất. Các lipit không xà phòng hóa được thu nhận bằng cách sử dụng hỗn hợp dung môi n- hexane-cloroform (4:1, thể tích/thể tích). Dung dịch chứa lipit không xà phòng hóa được làm khô trên đĩa kính đồng hồ và hòa tan lại trong cloroform. Mẫu này được sử dụng để chạy sắc ký lớp mỏng.
- Chạy sắc ký lớp mỏng: Lipit không xà phòng hóa được phân tách trên bản sắc ký lớp mỏng (TLC) 20 x 20 cm có phủ silicagel 60 (Merck) với pha động là hệ dung môi n-hexan/diethyleter/axit acetic (70:30:4, thể tích/thể tích/thể tích). Các băng trên bản sắc ký được phát hiện bằng cách phun dung dịch H2SO4 20% và sấy khô ở 1000
2.2.9. Tinh sạch squalene bằng phƣơng pháp sắc kí cột
Squalene trong phần lipit không xà phòng hóa sẽ được tinh sạch bằng cột Silicagel 60, 0,06 - 0,2 mm cho sắc ký cột (70 - 230 mesh ASTM). 5g dung dịch không xà phòng hóa giàu squalene hòa tan trong 5mL n-hexan được đưa lên cột, rửa cột và thu phân đoạn với 100% n-hexan ở tốc độ dòng chảy 1,0 mL/min. Thu các phân đoạn trong ống facol 15mL. Sử dụng sắc ký bản mỏng để xác định sự có mặt của các phân đoạn thu được.
2.2.10. Xác định squalene bằng sắc ký lỏng cao áp
Squalene được phân tích bằng sắc ký lỏng cao áp với cột sắc ký lỏng Thermo Hypersild Gold C18 (150 x 2,1 mm, 3 µm), pha động là dung dịch acetonitrile : nước (9:1, thể tích/thể tích), tốc độ dòng 250 µL/min. Sự nhận dạng squalene được thực hiện bằng cách sử dụng đầu dò PDA Accella với khoảng quét 190-400 nm, bước sóng UV đặt ở 198 nm và thời gian lưu của mẫu có chứa squalene được so sánh với thời gian lưu của squalene chuẩn. Hàm lượng squalene trong mẫu được xác định dựa trên đường chuẩn về mối tương quan giữa nồng độ của squalene chuẩn với diện tích peak tương ứng.
Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Excel 2007 và xử lý thống kê ANOVA ở mức ý nghĩa P ≤ 0,05.
CHƢƠNG III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Trong bộ sưu tập giống của Phòng Công nghệ Tảo, chúng tôi lựa chọn sàng lọc 7 loài vi tảo biển trong đó có 5 loài quang tự dưỡng và 2 loài dị dưỡng để xác định hàm lượng squalene theo định hướng tìm loài tiềm năng cho nuôi trồng trên quy mô lớn để thu sinh khối giàu squalene cho mục đích thương mại sản phẩm sau này. Chủng giống tảo sạch, thuần chủng được bảo quản và nhân giống sơ cấp ở điều kiện phòng thí nghiệm. Sinh khối tảo quang tự dưỡng được thu hoạch ở thời điểm trước pha cân bằng và sinh khối tảo dị dưỡng được thu hoạch sau 4 ngày nuôi cấy.
Hiện nay có rất nhiều phương pháp tách chiết và tinh sạch squalene như: phương pháp chưng cất khử mùi (deodorization distillate), sử dụng CO2 siêu tới hạn, sử dụng các dung môi hữu cơ như n-hexan và phương pháp sắc ký cột silica gel… Tuy nhiên, trong điều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam, để phù hợp với điều kiện kinh phí, chúng tôi nhận thấy cần phải thiết lập các phương pháp đơn giản, dễ làm, tương đối rẻ tiền nhằm tách chiết và tinh sạch squalene với mong muốn thương mại hóa sản phẩm này. Các phương pháp nghiên cứu được dùng để xác định hàm lượng squalene có trong sinh khối vi tảo biển quang tự dưỡng và dị dưỡng có thể là phương pháp so màu, TLC, sắc ký cột, HPLC.
3.1. Nuôi trồng đủ sinh khối vi tảo biển quang tự dƣỡng và dị dƣỡng làm nguyên liệu cho tách chiết squalene
Điều kiện nuôi cấy 5 loài vi tảo biển quang tự dưỡng và 2 loài dị dưỡng được sử dụng trong nghiên cứu được chỉ ra trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Danh sách 5 loài vi tảo biển quang tự dƣỡng, 2 loài dị dƣỡng và điều kiện nuôi cấy chúng trong điều kiện phòng thí nghiệm
STT Tên loài Điều kiện nuôi cấy
1 Chlorelavulgaris Môi trường Walne; 30‰; 300C; pH 7; 60 mol/m2s 2 Dunaliella tertiolecta Môi trường Walne; 30‰; 250C; pH = 7 – 9; 60
mol/m2s
3 Isochrysis galbana Môi trường Walne; 30‰; 300
C; pH 7; 60 mol/m2s 4 Nannochloropsisoculata Môi trường Walne; 30‰; 300C; pH 7; 100 mol/m2s 5 Tetraselmis convolutae Môi trường Walne; 30‰; 300C; pH 7; 60 mol/m2s 6 Schizochytrium
mangrovei PQ6
Môi trường M1; 280C; pH=6,5-7; lắc 200 vòng/phút
7 Thraustochytrium striatum
Môi trường Bajpai cải tiến; 280C; pH=6,5-7; lắc 200 vòng/ phút
Hình thái tế bào của 5 loài vi tảo biển quang tự dưỡng chụp dưới kính hiển vi quang học được chỉ ra trên hình 3.1.
Hình 3.1. Hình thái tế bào của 5 loài vi tảo biển quang tự dƣỡng chụp dƣới kính hiển vi quang học
x 1700 x 1500
Chlorella vulgaris Dunaliellatertiolecta Isochrysis galbana Nannochloropsis oculata Tetraselmisconvolutae
Hình chụp khuẩn lạc và tế bào của chủng Schizochytrium mangrovei và
Thraustochytrium striatum được chỉ ra trên hình 3.2.
A
B
Hình 3.2. Hình chụp khuẩn lạc và tế bào của chủng Schizochytrium mangrovei
PQ6 (A) và Thraustochytrium striatum (B)
Hình ảnh minh họa cho việc nuôi trồng thành công các loài vi tảo biển quang tự dưỡng (Hình 3.3) và dị dưỡng để cung cấp đủ sinh khối cho tách chiết và làm sạch squalene tiếp theo (Hình 3.4).
Hình 3.3. Hệ thống nuôi trồng các loài vi tảo biển quang tự dưỡng ở các quy mô bình từ 250 mL đến bình 10 lít
Hình 3.4. Hình ảnh minh họa nuôi trồng chủng Schizochytrium mangrovei PQ6 và Thraustochytrium striatum ở trong phòng thí nghiệm
Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn sàng lọc 7 loài vi tảo biển bao gồm 5 loài quang tự dưỡng Chlorella vulgaris, Dunaliella teriolecta, Isochrysis galbana, Nannochloropsis oculata, Tetraselmis convolutae và 2 loài dị dưỡng là
Schizochytrium mangrovei và Thraustochytrium striatum. Đây là các loài vi tảo đã được nghiên cứu sâu về đặc điểm sinh lý, sinh hóa. Một tiêu chí quan trọng để lựa chọn các loài vi tảo này để nghiên cứu là khả năng nuôi trồng trên qui mô lớn, năng suất sản xuất sinh khối cao, có thể được ứng dụng cho việc thương mại hóa sản phẩm squalene sau này.
Sinh khối tảo quang tự dưỡng sử dụng cho tách chiết lipit và xác định hàm lượng squalene được thu hoạch ở thời điểm trước pha cân bằng và sinh khối tảo dị dưỡng được thu hoạch sau 4 ngày nuôi cấy. Sinh khối khô được đặt trong desicator.
3.2. Sàng lọc nhanh các chủng vi tảo có tiềm năng sản xuất squalene cao 3.2.1. Phát hiện nhanh lipit nội bào bằng nhuộm Nile Red 3.2.1. Phát hiện nhanh lipit nội bào bằng nhuộm Nile Red
Phương pháp nhuộm Nile Red đã được áp dụng thành công để phát hiện sự có mặt của các hạt lipit trung tính trong tế bào nhiều loài vi tảo khác nhau [20], [54], [29]. Dưới kính hiển vi huỳnh quang vớ
450–490 nm và ánh sáng phát huỳnh quang của Nile Red ở bước sóng 540-640 nm,
2 ngày 1 ngày
0 ngày
các hạt lipit nội bào gồm triglyceride và các hydrocacbon như squalene có màu vàng sáng (Hình 3.5). Mức độ bắt màu vàng của các tế bào Schizochytrium mangrovei và Thraustochytrium striatum cao hơn so với 5 loài vi tảo quang tự dưỡng còn lại. Do vậy, có thể thấy rằng, hàm lượng lipit trong tế bào hai loài vi tảo dị dưỡng cao hơn nhiều so với các loài vi tảo quang tự dưỡng.
Kỹ thuật nhuộm lipit bằng Nile red là một phương pháp có hiệu quả, cho phép sàng lọc nhanh những loài vi tảo chứa hàm lượng lipit cao, nhằm mục đích tách chiết, xác định được hàm lượng squalene trong sinh khối vi tảo biển để bước đầu tìm ra được một số chủng tiềm năng trong việc thương mại hóa việc sản xuất squalene theo ứng dụng dược phẩm và thực phẩm chức năng.
A
B
Hình 3.5. Ảnh chụp tế bào dƣới kính hiển vi quang học (A) và kính hiển vi