KN–KT = Phức hợp kháng nguyên kháng thể. KKT = KT của động vật kháng với KT của người. Cộng hợp = KKT gắn men.
4.1. Nguyên tắc
Kháng nguyên được gắn lên giếng nhựa, khi gặp kháng thể tương ứng sẽ kết hợp tạo thành phức hợp KN–KT. Phức hợp KN–KT được phát hiện nhờ men gắn vào KKT, men phản ứng với một cơ chất và làm đổi màu. Kết quả có thể được đọc bằng mắt hoặc máy đọc ELISA.
4.2. Dụng cụ và hóa chất
– Ống nghiệm
– Giá đựng ống nghiệm
– Micropipette có các thể tích khác nhau từ 1µl đến 1000µl
– Đầu nhựa gắn vào Micropipette, 2 loại: màu vàng (cho loại nhỏ) và màu xanh dương (cho loại to 100– 1000µl)
– Bình nhựa đựng nước rửa (0,5 lít, 1 lít) – Giấy thấm để đập cho các giếng ráo nước
– Máy đọc ELISA (nếu có thì tốt, không có máy thì đọc kết quả bằng mắt) – Bộ thử nghiệm gồm có:
+ Các thanh nhựa đã gắn kháng nguyên + Dung dịch rửa
+ Dung dịch pha loãng huyết thanh + Cộng hợp
+ Chứng âm + Chứng dương + Cơ chất
+ Chất ngưng phản ứng (acid hoặc bazơ).
4.3. Quy trình kỹ thuật
Thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Quy trình gồm các bước sau đây:
Cho 100µl huyết thanh bệnh nhân, chứng âm, chứng dương vào giếng nhựa đã gắn sẵn kháng nguyên. Ủ ở 37oC trong 1 giờ.
Rửa 5 lần các giếng bằng dung dịch đệm PBS – Tween 20. ƒ Đập cho ráo nước.
Cho 100µl cộng hợp vào mỗi giếng, ủ ở 37oC trong 1 giờ. Rửa 5 lần các giếng bằng dung dịch đệm PBS – Tween 20. Đập cho ráo nước.
Cho 100ml cơ chất vào mỗi giếng, chờ cho màu xuất hiện (15 – 30 phút). Cho acid hoặc bazơ vào để ngưng phản ứng.
Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA tự động hoặc bằng mắt. Kết quả dương tính khi có hiện màu, âm tính thì không có màu.
4.4. Biện luận kết quả
– Ngưỡng dương tính có thể khác nhau đối với từng loại bệnh KST. Biện luận kết quả dựa trên ngưỡng dương tính do nhà sản xuất đưa ra.
– Các kỹ thuật miễn dịch phát hiện kháng thể cho kết quả gián tiếp, không có giá trị tuyệt đối.
– Kết quả âm tính cũng không loại trừ hoàn toàn nhiễm KST, có thể do mới bị nhiễm, hoặc bị nhiễm quá lâu, hoặc lượng KST quá ít để có thể kích thích được hệ miễn dịch. Trong trường hợp nghi ngờ trên lâm sàng nên làm lại thử nghiệm. Xét nghiệm vài lần để theo dõi biến động của kháng thể có giá trị hơn là xét nghiệm một lần. Nếu cần, phải kiểm tra lại bằng các kỹ thuật khác.
– Kết quả dương tính cũng không khẳng định hoàn toàn bị nhiễm KST vì có thể dương tính giả do phản ứng chéo giữa các loại KST.
Vì vậy, các phản ứng miễn dịch tìm kháng thể không thể thay thế hoàn toàn xét nghiệm trực tiếp trong chẩn đoán nguyên nhân bệnh. Kết quả xét nghiệm, dù âm hay dương, cũng cần được xem xét một cách cẩn thận, kết hợp với các yếu tố dịch tễ và triệu chứng lâm sàng.