Nguyên tắc: Giống nhƣ kỹ thuật PCR thông thƣờng, kỹ thuật Real time-PCR cũng dựa trên khả năng nhân bản một trình tự ADN đích khi có mặt cặp mồi đặc hiệu của enzyme ADN polymerase. Tuy nhiên, khác với kỹ thuật PCR thông thƣờng, Real time-PCR cho phép phát hiện và định lƣợng sự tích lũy các sản phẩm khuyếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra do trong hỗn hợp phản ứng có bổ sung thêm chất phát tín hiệu. Chất phát tín hiệu này khi liên kết với sản phẩm PCR sẽ phát tín hiệu huỳnh
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 47 Khãa 2009 - 2011
quang (SYBR Green) hay bị phân hủy do hoạt tính 5’-3’ exonulease của Taq polymerase trong quá trình kéo dài chuỗi (Taqman probe) và đƣợc bộ phận phát hiện huỳnh quang của máy Real- PCR thu nhận. Tín hiệu huỳnh quang đo đƣợc phản ánh lƣợng sản phẩm khuyếch đại trong mỗi chu kỳ. Chính vì vậy, kỹ thuật Real-time PCR có độ chính xác và độ nhạy rất cao, tiết kiệm thời gian. Hơn nữa, kỹ thuật này còn giúp giảm nguy cơ ngoại nhiễm và các thao tác sau phản ứng khuyếch đại.
Trong nghiên cứu này, kỹ thuật Real-time PCR đƣợc sử dụng để đánh giá khả năng tách chiết ADN EBV của bộ kít Virus Magnet Nano Kit với hai bộ kít thƣơng mại MinElute® Virus Spin Kit của hãng Qiagen và Dynabeads Myone
SILANE® của hãng Invitrogen thể hiện bằng số copies ADN EBV trong các mẫu
máu mà các bộ kít này tách đƣợc. Chất phát huỳnh quang đƣợc sử dụng trong phản ứng là Taqman probe đặc hiệu cho đoạn gen đích EBV có kích thƣớc 74 bp (ký hiệu là EBV-74), sự phân giải của probe sẽ làm tách rời chất phát huỳnh quang ở đầu 5’ khỏi chất hấp phụ huỳnh quang (quencher) ở đầu 3’ của probe và phát tín hiệu huỳnh quang, tín hiệu này sẽ đƣợc ghi nhận bởi đầu đọc real-time của máy. Kết quả đƣợc phân tích bằng phần mềm IQ5 Optical System (Bio - Rad).
Thành phần của phản ứng Real-time PCR Thể tích
- Master Mix Roche (2x) 10 µl
- Mồi EBV Fw3 xuôi (10 pmol) 0.75 µl
- Mồi EBV Rv3 ngƣợc (10 pmol) 0.75 µl
- Taq man probe (5pmol) 0.5 µl
- H20 3 µl
- Khuôn ADN EBV 5 µl
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 48 Khãa 2009 - 2011
Chu kỳ nhiệt
45 chu kỳ
Giai đoạn biến tính 950C – 15 giây
Giai đoạn gắn mồi và kéo dài 600C – 1 phút
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. NHÂN DÒNG ĐẶC HIỆU ĐOẠN GEN EBNA-2/250
Các bƣớc thí nghiệm chính bao gồm: Tách chiết hệ gen của EBV, nhân bản đoạn gen đặc hiệu bằng kỹ thuật PCR (nested PCR với hai lần phản ứng PCR độc lập và nested PCR một lần PCR duy nhất), kiểm tra kết quả bằng điện di trên gel agarose 1,5%, nhân dòng sản phẩm nested PCR đoạn gen đặc hiệu cho EBV vào vector pGEM-T easy, giải trình tự gen đã đƣợc nhân dòng, so sách trình tự gen giải đƣợc với gen cùng loại đã công bố trên ngân hàng gen thế giới bằng phần mềm GENETYX.
3.1.1. Nhân bản đoạn gen đặc hiệu của EBV bằng nested PCR với hai lần phản ứng PCR độc lập ứng PCR độc lập
Theo công bố của Van B. D. và cs năm 2010, chúng tôi đã lựa chọn đoạn gen mã hóa cho kháng nguyên nhân của EBV có kích thƣớc 250 bp (EBV-2/250) làm gen đích cho nhân bản bằng nested PCR [32]. Gen EBNA mã hóa cho protein kháng nguyên nhân của EBV. Phản ứng nested PCR nhân bản đoạn gen EBNA-2/250 đặc hiệu của EBV đƣợc thực hiện với hai lần phản ứng PCR độc lập và thành phần các phản ứng nhƣ đã đƣợc trình bày trong phần phƣơng pháp nghiên cứu mục 2.2.2.1. Sản phẩm nested PCR này đƣợc điện di trên gel Agarose 1,5%.
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 49 Khãa 2009 - 2011
Hình 3.1: Kết quả điện di sản phẩm nested PCR với hai lần phản ứng PCR độc lập đặc hiệu cho gen EBNA-2/250
M: thang chuẩn ADN 100 bp;
Đƣờng chạy 1: đối chứng âm (không có ADN khuôn)
Đƣờng chạy 2: khuôn là ADN tinh sạch từ mẫu máu nhiễm EBV
Kết quả điện di sản phẩm nested PCR đƣợc thể hiện trên hình 3.1 cho thấy, ở đƣờng chạy 1 ứng với sản phẩm PCR của đối chứng âm không xuất hiện băng sản phẩm PCR, còn đƣờng chạy 2 tƣơng ứng với khuôn là ADN tách từ mẫu huyết thanh bệnh nhân nhiễm EBV xuất hiện duy nhất một băng có kích thƣớc khoảng 250 bp phù hợp với tính toán theo lý thuyết của đoạn gen EBNA-2 với các cặp mồi nhân bản đặc hiệu cho đoạn gen này. Kết quả trên bƣớc đầu cho phép chúng tôi tạm kết luận là đã nhân bản thành công đoạn gen EBNA-2 kích thƣớc 250 bp.
3.1.2. Nhân bản đoạn gen đặc hiệu của EBV bằng nested PCR với một lần PCR và một chu trình nhiệt duy nhất PCR và một chu trình nhiệt duy nhất
bp 300 200 100 M 1 2 250
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 50 Khãa 2009 - 2011
Nhƣợc điểm của phản ứng nested PCR với hai lần chạy PCR độc lập ở mục 3.1.1 là phải thực hiện phản ứng PCR hai lần, sản phẩm PCR lần 1 làm khuôn cho phản ứng PCR lần 2 mới nhân bản đƣợc đoạn gen EBNA-2/250 mong muốn. Điều này làm mất rất nhiều thời gian, hóa chất, tốn công và không thực hiện đƣợc phản ứng Real- time PCR. Nên chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu tối ƣu hóa lƣợng khuôn, lƣợng mồi, chu trình nhiệt để gộp các phản ứng trong PCR ở mục 3.1.1 thành một phản ứng với một chu trình nhiệt duy nhất. Tuy nhiên, sản phẩm PCR vẫn xuất hiện nhiều băng ADN phụ. Do đó, chúng tôi đã tiến hành thiết lại cặp mồi PCR lần một để nâng nhiệt độ gắn mồi của phản ứng này lên hơn 600C, cụ thể thêm 3 nucleotid ở đầu 5’ của mồi xuôi EBVex Fw và 4 nucleotid ở đầu 5’ của mồi ngƣợc EBVex Rv tạo cặp mồi mới cho PCR lần một là EBVex2 Fw, EBVex2 Rv với trình tự và nhiệt độ gắn mồi đƣợc trình bày chi tiết trong bảng 3.1.
Bảng 3.1: Trình tự cặp mồi EBVex 2 Fw/Rv và EBVex Fw/Rv
Tên mồi Trình tự mồi Nhiệt độ gắn
mồi (Tm)
EBVex Fw 5’-tggaaacccgtcactctc-3’ 540C
EBVex Rv 5’-AATGGCATAGGTGGAATG-3’
EBVex2 Fw 5’-tgttggaaacccgtcactctc-3’ 620C
EBVex2 Rv 5’-GGGTAATGGCATAGGTGGAATG-3’
Với sự thay đổi nhƣ trên chúng tôi nhận đƣợc nhiệt độ gắn mồi của cặp mồi dùng trong phản ứng PCR lần 1 mới lớn hơn 600
C, nhiệt độ gắn mồi này giúp chúng tôi nâng đƣợc điều kiện gắn mồi cho PCR lần một lên trên 600C để loại bỏ các đoạn sản phẩm ADN nhân lên không đặc hiệu khi trộn cả 2 cặp mồi của nested PCR hai lần PCR độc lập trong 1 phản ứng. Tiếp theo chúng tôi tiến hành tối ƣu hóa nồng độ mồi, nồng độ khuôn ADN, chu kỳ nhiệt của phản ứng nested PCR một lần.
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 51 Khãa 2009 - 2011
Sau các thí nghiệm chúng tôi nhận đƣợc chu trình nhiệt và điều kiện tối ƣu cho nested PCR một lần với một chu trình nhiệt duy nhất nhƣ sau:
Các thành phần của phản ứng Thể tích
- Đệm Taq ADN polymerase 10x 2,5 µl
- Taq ADN polymerase 5 unit/ µl 0,5 µl
- dNTPs 2,5 mM 2,5 µl - EBVex 2 Fw 5 pmol 1 µl - EBVex 2 Rv 5 pmol 1 µl - EBV Fw in 10 pmol 1 µl - EBV Rv in 10 pmol 1 µl - H2O cất khử trùng, khử ion 10, 5 µl - ADN khuôn 5 µl - Tổng thể tích phản ứng 12 µl Chu kỳ nhiệt 5 chu kỳ đầu 940C – 1 phút 30 chu kỳ sau 940C – 30 giây 600C – 1 phút 540C – 1 phút 720C – 2 phút 720C – 1 phút
Với chu trình nhiệt và thành phần phản ứng nhƣ trên chúng tôi thu đƣợc kết quả nested PCR mới (hình 3.2).
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 52 Khãa 2009 - 2011
Hình 3.2: Kết quả điện di sản phẩm nested PCR với các điều kiện tối ƣu đặc hiệu cho gen EBNA-2/250
Đƣờng chạy M: Thang ADN chuẩn 100 bp
Đƣờng chạy (-): 5 µl H2O
Đƣờng chạy 1, 2: 5 µl ADN EBV tinh sạch
Từ kết quả điện di trên hình 3.2 ta thấy trên đƣờng chạy số 1 và 2 chỉ xuất hiện duy nhất một băng ADN duy nhất có kích thƣớc khoảng 250 bp trùng với kích thƣớc dự đoán lý thuyết của đoạn gen EBNA-2/250, còn đƣờng chạy đối chứng âm không xuất hiện băng ADN nào. Do vậy chúng tôi có thể kết luận đã tối ƣu hóa đƣợc điều kiện phản ứng và thiết kế mồi thành công cặp mồi EBVex2 Fw/Rv cho phản ứng nested PCR một lần phản ứng và một chu trình nhiệt duy nhất. Sản phẩm nested PCR với cặp mồi mới nhân bản đặc hiệu cho đoạn gen EBNA-2 kích thƣớc 250 bp sau đó đã đƣợc chúng tôi nhân dòng để dùng làm đối chứng dƣơng hay mẫu chuẩn dùng cho phân tích định tính và định lƣợng EBV ở những thí nghiệm tiếp theo.
M (-) 1 2 300 200 100 250 bp
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 53 Khãa 2009 - 2011
3.1.3. Kết quả nhân dòng đoạn gen EBNA-2/250
Sản phẩm nested PCR một vòng nhân bản đặc hiệu đoạn gen EBNA-2/250 đƣợc gắn vào vector pGEM-T dƣới sự xúc tác của enzyme T4-ligase. Phản ứng gắn (ligation) dựa vào sự hình thành mối liên kết photphodieste giữa nucleotide Adenine của sản phẩm PCR và nucleotide Thymine của vector pGEM-T Easy
Hình 3.3: Sơ đồ vector pGEM-T Easy
Quy trình nhân dòng đã đƣợc trình bày chi tiết ở mục 2.2.3. Sau khi biến nạp chúng tôi đã thu đƣợc một lƣợng lớn các khuẩn lạc xanh và trắng (hình 3.4). Toàn bộ các khuẩn lạc phát triển trên môi trƣờng có chứa ampicillin đều là khuẩn lạc mang plasmid vì sự có mặt của plasmid mang đến cho vi khuẩn tính kháng ampicilin. Những khuẩn lạc xanh xuất hiện là do trong vector pGEM-T mang lac-operon hoạt động bình thƣờng, không có đoạn gen đƣợc chèn vào, khi có chất cảm ứng IPTG sẽ tổng hợp enzyme β – galactosidase, enzyme này sẽ chuyển hóa cơ chất X-gal thành hợp chất có màu xanh. Còn những khuẩn lạc trắng có thể nhận đƣợc những plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen cần chèn vào do vậy làm cho
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 54 Khãa 2009 - 2011
lac-operon không hoạt động do đó không thể chuyển hóa cơ chất X-gal thành sản phẩm màu xanh.
Hình 3.4: Kết quả biến nạp hỗn hợp sau phản ứng gắn giữa sản phẩm PCR với vector pGEM-T vào E.coli chủng DH5α
Phần lớn các khuẩn lạc trắng mang plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen cần nhân dòng EBNA-2/250 nên chúng tôi đã tiến hành tách plasmid theo phƣơng pháp đã trình bày ở mục 2.2.4 của 3 dòng khuẩn lạc để kiểm tra sự có mặt của đoạn gen EBNA-2/250 cần nhân dòng trong các tế bào mang vector tái tổ hợp.
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 55 Khãa 2009 - 2011
Kết quả điện di sản phẩm tách plasmid từ các khuẩn lạc trắng trên hình 3.5 cho thấy plasmid tái tổ hợp thu đƣợc có chất lƣợng tốt đủ điều kiện cho các nghiên cứu tiếp theo.
Để kiểm tra sự có mặt của đoạn gen EBNA-2/250 trong các plasmid tách từ các khuẩn lạc trắng chúng tôi đã tiến hành nested PCR với các thành phần và chu trình nhiệt nhƣ mục 3.1.2.
Hình 3.6: Kết quả điện di sản phẩm nested PCR chọn lọc khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen EBNA-2/250.
Đƣờng chạy M: Thang chuẩn ADN 100 bp Đƣờng chạy (-): chứng âm 2µl H20
Đƣờng chạy (+): 5µl ADN EBV
Đƣờng chạy1-3: ADN plasmid tách từ các khuẩn lạc trắng
Kết quả điện di sản phẩm PCR chọn lọc các dòng khuẩn lạc trắng mang đoạn gen EBNA-2/250 trên hình 3.6 cho thấy các đƣờng chạy 1-3 tƣơng ứng với các khuôn ADN là plasmid tách từ các khuẩn lạc trắng xuất hiện băng ADN kích thƣớc khoảng 250 bp, còn trên đƣờng chạy đối chứng dƣơng cũng xuất hiện băng ADN nhƣ vậy, trong khi đó đƣờng chạy đối chứng âm không lên băng ADN nào. Điều này cho thấy đoạn gen EBNA-2/250 đã đƣợc nhân dòng vào vector pGEM-T và cả
M (-) (+) 1 2 3 bp 300 200 100 250
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 56 Khãa 2009 - 2011
3 dòng khuẩn lạc trắng chúng tôi chọn để tách chiết plasmid đều mang vector tái tổ hợp chứa đoạn gen EBNA-2/250 cần nhân dòng.
Kết quả giải trình tự đoạn gen EBNA-2/250 đã được nhân dòng vào vector pGEM-T
Để kết luận chính xác đoạn gen EBNA-2/250 đã đƣợc nhân dòng đúng là của EBV chúng tôi tiến hành giải trình tự đoạn gen này trong plasmid pGEM-T tái tổ hợp thu đƣợc ở thí nghiệm trên, với sự hỗ trợ của hệ thống giải trình tự gen CEQ-8000 Beckman coulter. Chúng tôi đã sử dụng mồi pUC19 Rv đƣợc thiết kế có vị trí gắn trên vector pGEM-T để giải trình tự toàn bộ đoạn gen EBNA-2/250 nhân dòng đƣợc.
Hình 3.7: Kết quả giải trình tự đoạn gen EBNA-2/250 trên plasmid pGEM-T
Trình tự gen EBNA-2/250 sau khi giải trình tự đƣợc so sánh với trình tự gen EBNA-2 chủng AG876 của Quảng Đông Trung Quốc đã đƣợc công bố trên ngân hàng gen thế giới.
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 57 Khãa 2009 - 2011
Hình 3.8: Kết quả so sánh trình tự đoạn gen EBNA-2/250 sau khi giải trình tự với trình tự gen EBNA-2 chủng AG876.
Kết quả giả trình tự và so sánh cho thấy đoạn gen EBNA-2/250 trên vector pGEM-T tái tổ hợp có độ tƣơng đồng 100% với đoạn gen trên EBNA-2 chủng AG876 của Quảng Đông Trung Quốc. Từ các kết quả trên chúng tôi có thể kết luận đã nhân dòng thành công đoạn gen EBNA-2/250 vào vector pGEM-T. Plasmid tái tổ hợp này sẽ đƣợc làm chứng dƣơng trong các phản ứng định tính phát hiện EBV bằng phƣơng pháp PCR.
3.2. KẾT QUẢ NHÂN DÒNG ĐOẠN GEN EBV- 74
Theo công bố của Niesters H.G. và cs năm 1999, chúng tôi tiến hành thiết kế cặp mồi EBVFw3/Rv3 [26] để nhân bản đoạn gen mã hóa cho protein màng BNRF1 p143 không chứa nhóm glycosyl kích thƣớc 74 bp đặc hiệu cho EBV (kí
(100.00% 250bp)
EBNA-2/250 TTAGGGATGC CTGGACACAA GAGCCATCAC CTCTTGATAG GGATCCGCTA EBNA AG876 ********** ********** ********** ********** ********** TTAGGGATGC CTGGACACAA GAGCCATCAC CTCTTGATAG GGATCCGCTA GGATATGATG TCGGGCATGG ACCTCTAGCA TCTGCTATGC GAATGCTTTG GATGGCTAAT ********** ********** ********** ********** ********** ********** GGATATGATG TCGGGCATGG ACCTCTAGCA TCTGCTATGC GAATGCTTTG GATGGCTAAT TATATTGTAA GACAATCACG GGGTGACCGG GGCCTTATGT TGCCACAAGG CCCACAAACA ********** ********** ********** ********** ********** ********** TATATTGTAA GACAATCACG GGGTGACCGG GGCCTTATGT TGCCACAAGG CCCACAAACA GCCCCCCAGG CCGTGTTGGT ACAGCCACAT GTCCCCCCTC TACGCCCGAC AGCACCCACC ********** ********** ********** ********** ********** ********** GCCCCCCAGG CCGTGTTGGT ACAGCCACAT GTCCCCCCTC TACGCCCGAC AGCACCCACC ATTTTGTCAC CTCTGTCACA
********** ********** ATTTTGTCAC CTCTGTCACA
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 58 Khãa 2009 - 2011
hiệu: EBV-74). Sau đó nhân dòng đoạn gen này để tạo chất chuẩn và đối chứng dƣơng sử dụng trong phản ứng Real-time PCR với probe Taq man (FAM-TAMRA) định lƣợng nồng độ EBV.
3.2.1. Nhân bản đoạn gen EBV-74
Phản ứng PCR nhân bản đặc hiệu đoạn gen EBV-74 với thành phần phản ứng và chế độ nhiệt nhƣ đã trình bày ở phần phƣơng pháp mục 2.2.2.2. Kết quả PCR đƣợc thể hiện trên hình 3.9 cho thấy ở đƣờng chạy số 1 là sản phẩm PCR bằng cặp mồi EBV Fw3Rv3 với khuôn là ADN EBV xuất hiện băng ADN kích thƣớc khoảng 74 bp, phù hợp với dự đoán lý thuyết đoạn ADN đƣợc nhân bản với cặp mồi EBV Fw3/Rv3 có kích thƣớc 74 bp. Còn đƣờng chạy chứng âm với mẫu chứng âm là H2O không xuất hiện băng ADN.
Hình 3.9: Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi EBV Fw3Rv3 trên gel polyacrylamid 12%
Đƣờng chạy M: Low range Marker Đƣờng chạy (-): chứng âm (5 µl H2O) M (-) 1 bp 100 75 50 74
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ