Phản ứng đƣợc thực hiện do khả năng gắn thêm một gốc Adenosine monophosphat (A) vào đầu 3’ của sản phẩm PCR nhờ hoạt tính terminal transferase không phụ thuộc vào trình tự khuôn của Taq polymarse. Trong khi đó, vector nhân dòng pGEM-T của hãng promega đƣợc thiết kế có gốc thymidine monophosphate (T) ở đầu 5’.
Sản phẩm PCR đƣợc nhân dòng vào vector pGEM-T easy. Các bƣớc cụ thể nhƣ sau:
Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector đƣợc thực hiện trong thể tích 10 µl
STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Sản phẩm PCR 2 2 Đệm T4 ADN ligase 2X 5 3 Vector pGEM T 1 4 ddH2O 1 5 T4 ADN ligase 1
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 44 Khãa 2009 - 2011
Tổng thể tích 10
Hỗn hợp phản ứng đƣợc trộn đều và ủ 1 giờ phút ở nhiệt độ phòng. Sau khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp đƣợc nhanh chóng sử dụng cho bƣớc biến nạp vào tế bào E.
coli dòng DH5α.
Việc biến nạp đƣợc thực hiện bằng cách bổ sung 3 µl dung dịch phản ứng gắn ở trên vào 50 µl dung dịch tế bào E. coli khả biến, hỗn hợp đƣợc trộn đều và giữ trên đá 10-15 phút, sau đó hỗn hợp nhanh chóng đƣợc chuyển sang ủ ở 420C trong 45 giây và lại chuyển hỗn hợp trở lại trên đá trong 2 phút (bƣớc gây sốc nhiệt). Tiếp theo, hỗn hợp phản ứng đƣợc trộn với 300 µl dung dịch môi trƣờng LB đã đƣợc ủ trƣớc ở 370C và đƣợc giữ tiếp ở 370C, kết hợp lắc nhẹ (150 vòng/phút) trong 20 phút để phục hồi các tế bào sau khi bị sốc nhiệt. Cuối cùng 50-100 µl dung dịch tế bào đƣợc cấy trải lên đĩa thạch (chuẩn bị trong môi trƣờng LB và đƣợc phủ bằng X-gal và chất cảm ứng IPTG). Các đĩa thạch sau đó đƣợc chuyển vào tủ ấm 370C cho đến khi quan sát thấy sự hình thành các khuẩn lạc rõ rệt (sau 12- 20 giờ nuôi cấy).