Sản phẩm nested PCR một vòng nhân bản đặc hiệu đoạn gen EBNA-2/250 đƣợc gắn vào vector pGEM-T dƣới sự xúc tác của enzyme T4-ligase. Phản ứng gắn (ligation) dựa vào sự hình thành mối liên kết photphodieste giữa nucleotide Adenine của sản phẩm PCR và nucleotide Thymine của vector pGEM-T Easy
Hình 3.3: Sơ đồ vector pGEM-T Easy
Quy trình nhân dòng đã đƣợc trình bày chi tiết ở mục 2.2.3. Sau khi biến nạp chúng tôi đã thu đƣợc một lƣợng lớn các khuẩn lạc xanh và trắng (hình 3.4). Toàn bộ các khuẩn lạc phát triển trên môi trƣờng có chứa ampicillin đều là khuẩn lạc mang plasmid vì sự có mặt của plasmid mang đến cho vi khuẩn tính kháng ampicilin. Những khuẩn lạc xanh xuất hiện là do trong vector pGEM-T mang lac-operon hoạt động bình thƣờng, không có đoạn gen đƣợc chèn vào, khi có chất cảm ứng IPTG sẽ tổng hợp enzyme β – galactosidase, enzyme này sẽ chuyển hóa cơ chất X-gal thành hợp chất có màu xanh. Còn những khuẩn lạc trắng có thể nhận đƣợc những plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen cần chèn vào do vậy làm cho
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 54 Khãa 2009 - 2011
lac-operon không hoạt động do đó không thể chuyển hóa cơ chất X-gal thành sản phẩm màu xanh.
Hình 3.4: Kết quả biến nạp hỗn hợp sau phản ứng gắn giữa sản phẩm PCR với vector pGEM-T vào E.coli chủng DH5α
Phần lớn các khuẩn lạc trắng mang plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen cần nhân dòng EBNA-2/250 nên chúng tôi đã tiến hành tách plasmid theo phƣơng pháp đã trình bày ở mục 2.2.4 của 3 dòng khuẩn lạc để kiểm tra sự có mặt của đoạn gen EBNA-2/250 cần nhân dòng trong các tế bào mang vector tái tổ hợp.
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 55 Khãa 2009 - 2011
Kết quả điện di sản phẩm tách plasmid từ các khuẩn lạc trắng trên hình 3.5 cho thấy plasmid tái tổ hợp thu đƣợc có chất lƣợng tốt đủ điều kiện cho các nghiên cứu tiếp theo.
Để kiểm tra sự có mặt của đoạn gen EBNA-2/250 trong các plasmid tách từ các khuẩn lạc trắng chúng tôi đã tiến hành nested PCR với các thành phần và chu trình nhiệt nhƣ mục 3.1.2.
Hình 3.6: Kết quả điện di sản phẩm nested PCR chọn lọc khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen EBNA-2/250.
Đƣờng chạy M: Thang chuẩn ADN 100 bp Đƣờng chạy (-): chứng âm 2µl H20
Đƣờng chạy (+): 5µl ADN EBV
Đƣờng chạy1-3: ADN plasmid tách từ các khuẩn lạc trắng
Kết quả điện di sản phẩm PCR chọn lọc các dòng khuẩn lạc trắng mang đoạn gen EBNA-2/250 trên hình 3.6 cho thấy các đƣờng chạy 1-3 tƣơng ứng với các khuôn ADN là plasmid tách từ các khuẩn lạc trắng xuất hiện băng ADN kích thƣớc khoảng 250 bp, còn trên đƣờng chạy đối chứng dƣơng cũng xuất hiện băng ADN nhƣ vậy, trong khi đó đƣờng chạy đối chứng âm không lên băng ADN nào. Điều này cho thấy đoạn gen EBNA-2/250 đã đƣợc nhân dòng vào vector pGEM-T và cả
M (-) (+) 1 2 3 bp 300 200 100 250
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 56 Khãa 2009 - 2011
3 dòng khuẩn lạc trắng chúng tôi chọn để tách chiết plasmid đều mang vector tái tổ hợp chứa đoạn gen EBNA-2/250 cần nhân dòng.
Kết quả giải trình tự đoạn gen EBNA-2/250 đã được nhân dòng vào vector pGEM-T
Để kết luận chính xác đoạn gen EBNA-2/250 đã đƣợc nhân dòng đúng là của EBV chúng tôi tiến hành giải trình tự đoạn gen này trong plasmid pGEM-T tái tổ hợp thu đƣợc ở thí nghiệm trên, với sự hỗ trợ của hệ thống giải trình tự gen CEQ-8000 Beckman coulter. Chúng tôi đã sử dụng mồi pUC19 Rv đƣợc thiết kế có vị trí gắn trên vector pGEM-T để giải trình tự toàn bộ đoạn gen EBNA-2/250 nhân dòng đƣợc.
Hình 3.7: Kết quả giải trình tự đoạn gen EBNA-2/250 trên plasmid pGEM-T
Trình tự gen EBNA-2/250 sau khi giải trình tự đƣợc so sánh với trình tự gen EBNA-2 chủng AG876 của Quảng Đông Trung Quốc đã đƣợc công bố trên ngân hàng gen thế giới.
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 57 Khãa 2009 - 2011
Hình 3.8: Kết quả so sánh trình tự đoạn gen EBNA-2/250 sau khi giải trình tự với trình tự gen EBNA-2 chủng AG876.
Kết quả giả trình tự và so sánh cho thấy đoạn gen EBNA-2/250 trên vector pGEM-T tái tổ hợp có độ tƣơng đồng 100% với đoạn gen trên EBNA-2 chủng AG876 của Quảng Đông Trung Quốc. Từ các kết quả trên chúng tôi có thể kết luận đã nhân dòng thành công đoạn gen EBNA-2/250 vào vector pGEM-T. Plasmid tái tổ hợp này sẽ đƣợc làm chứng dƣơng trong các phản ứng định tính phát hiện EBV bằng phƣơng pháp PCR.
3.2. KẾT QUẢ NHÂN DÒNG ĐOẠN GEN EBV- 74
Theo công bố của Niesters H.G. và cs năm 1999, chúng tôi tiến hành thiết kế cặp mồi EBVFw3/Rv3 [26] để nhân bản đoạn gen mã hóa cho protein màng BNRF1 p143 không chứa nhóm glycosyl kích thƣớc 74 bp đặc hiệu cho EBV (kí
(100.00% 250bp)
EBNA-2/250 TTAGGGATGC CTGGACACAA GAGCCATCAC CTCTTGATAG GGATCCGCTA EBNA AG876 ********** ********** ********** ********** ********** TTAGGGATGC CTGGACACAA GAGCCATCAC CTCTTGATAG GGATCCGCTA GGATATGATG TCGGGCATGG ACCTCTAGCA TCTGCTATGC GAATGCTTTG GATGGCTAAT ********** ********** ********** ********** ********** ********** GGATATGATG TCGGGCATGG ACCTCTAGCA TCTGCTATGC GAATGCTTTG GATGGCTAAT TATATTGTAA GACAATCACG GGGTGACCGG GGCCTTATGT TGCCACAAGG CCCACAAACA ********** ********** ********** ********** ********** ********** TATATTGTAA GACAATCACG GGGTGACCGG GGCCTTATGT TGCCACAAGG CCCACAAACA GCCCCCCAGG CCGTGTTGGT ACAGCCACAT GTCCCCCCTC TACGCCCGAC AGCACCCACC ********** ********** ********** ********** ********** ********** GCCCCCCAGG CCGTGTTGGT ACAGCCACAT GTCCCCCCTC TACGCCCGAC AGCACCCACC ATTTTGTCAC CTCTGTCACA
********** ********** ATTTTGTCAC CTCTGTCACA
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 58 Khãa 2009 - 2011
hiệu: EBV-74). Sau đó nhân dòng đoạn gen này để tạo chất chuẩn và đối chứng dƣơng sử dụng trong phản ứng Real-time PCR với probe Taq man (FAM-TAMRA) định lƣợng nồng độ EBV.
3.2.1. Nhân bản đoạn gen EBV-74
Phản ứng PCR nhân bản đặc hiệu đoạn gen EBV-74 với thành phần phản ứng và chế độ nhiệt nhƣ đã trình bày ở phần phƣơng pháp mục 2.2.2.2. Kết quả PCR đƣợc thể hiện trên hình 3.9 cho thấy ở đƣờng chạy số 1 là sản phẩm PCR bằng cặp mồi EBV Fw3Rv3 với khuôn là ADN EBV xuất hiện băng ADN kích thƣớc khoảng 74 bp, phù hợp với dự đoán lý thuyết đoạn ADN đƣợc nhân bản với cặp mồi EBV Fw3/Rv3 có kích thƣớc 74 bp. Còn đƣờng chạy chứng âm với mẫu chứng âm là H2O không xuất hiện băng ADN.
Hình 3.9: Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi EBV Fw3Rv3 trên gel polyacrylamid 12%
Đƣờng chạy M: Low range Marker Đƣờng chạy (-): chứng âm (5 µl H2O) M (-) 1 bp 100 75 50 74
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 59 Khãa 2009 - 2011
Đƣờng chạy 1: ADN EBV tinh sạch
Từ kết quả trên cho chúng tôi kết luận đã nhân bản thành công đoạn gen mã hóa cho protein màng tế bào BNRF1p143 không chứa nhóm glycosyl (EBV-74). Đoạn gen EBV-74 sau đó cũng đƣợc nhân dòng vào vector pGEM-T để làm đối chứng dƣơng và chất chuẩn trong các thí nghiệm định lƣợng bằng Real-time PCR tiếp theo.
3.2.2. Kết quả nhân dòng đoạn gen EBV-74
Tƣơng tự nhƣ phần nhân dòng đoạn gen EBNA-2/250 mục 3.1. Trong phần chọn dòng tế bào mang vector tái tổ hợp chứa đoạn gen EBV- 74, 2 plasmid tách từ các khuẩn lạc trắng đƣợc PCR với cặp mồi EBV Fw3/Rv3 để kiểm tra đoạn gen cần nhân dòng EBV-74 trong các plasmid tái tổ hợp thu đƣợc.
Hình 3.10: Kết quả điện di sản phẩm PCR chọn lọc khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen EBV-74
Đƣờng chạy M: Thang ADN chuẩn 100
75 50
bp M (-) (+) 1 2
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 60 Khãa 2009 - 2011
Đƣờng chạy (-): chứng âm Đƣờng chạy (+): 5 µl ADN EBV
Đƣờng chạy 1-2: ADN plasmid tách từ 2 khuẩn lạc trắng
Kết quả điện di thể hiện trên hình 3.10 cho thấy trên đƣờng chạy 1 và 2 đều xuất hiện băng ADN sản phẩm PCR kích thƣớc khoảng 74 bp, trùng với kết quả điện di sản phẩm PCR của đối chứng dƣơng là ADN EBV trong khi đó ở đƣờng chạy của đối chứng âm không xuất hiện băng ADN nào. Điều này cho thấy chúng tôi đã nhân dòng đƣợc đoạn gen EBV-74 vào vector pGEM-T, các plasmid tái tổ hợp tách chiết từ 2 dòng khuẩn lạc trắng đều mang đoạn gen EBV-74.
Plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen EBV-74 đƣợc dùng làm đối chứng dƣơng và chất chuẩn cho các phản ứng định lƣợng ADN EBV bằng Real- time PCR trong phần so sánh khả năng tách chiết axit nucleic của bộ kít Virus Magnet Nano Kit.
3.3. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT ADN EBV BẰNG BỘ KÍT TỰ CHẾ TẠO VIRUS
MAGNET NANO KIT
Chúng tôi nghiên cứu thử nghiệm khả năng tách chiết ADN EBV trong mẫu máu của bệnh nhân nhiễm EBV bằng bộ kít tự chế tạo Virus Magnet Nano Kit bao gồm hạt từ nano bọc silica (MagSi nano) và bộ đệm kèm theo.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tìm ra đƣợc điều kiện, quy trình thích hợp cho sử dụng hạt MagSi nano để tinh sạch ADN của EBV.
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 61 Khãa 2009 - 2011
Hình 3.11: Hình ảnh bộ kít Virus Magnet Nano Kit và thao tác tách chiết axit nucleic khi sử dụng bộ kít.
Quy trình tách chiết ADN EBV bao gồm các bƣớc từ xử lý hạt MagSi nano cho tới bƣớc ly giải virus, gắn kết ADN/ARN với hạt MagSi nano, rửa sạch để loại bỏ các tạp chất ra khỏi phức hệ ADN-MagSi nano và cuối cùng là tách thu đƣợc ADN tinh sạch. Đặc biệt trong qui trình này chúng tôi không sử dụng máy ly tâm và dùng nam châm để thao tác, điều này giảm thời gian và chi phí cho tách chiết ADN. Muối GuCNS trong đệm ly giải có vai trò quan trọng trong: phá màng tế bào, virus, ức chế các nuclease, là cầu nối liên kết giữa hạt silica với axit nucleic.
Chi tiết về các khâu tinh sạch đã đƣợc tối ƣu hóa của quy trình đƣợc trình bày ở mục 2.2.1.3
Sử dụng 5 µl ADN EBV tách chiết theo bộ kít Virus Magnet Nano Kit với mẫu bệnh phẩm là huyết thanh bệnh nhân đƣợc chẩn đoán nhiễm EBV đƣợc kiểm tra bằng PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho EBV.
bp 300 200 100 250 (-) M (+) 1
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 62 Khãa 2009 - 2011
Hình 3.12: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đặc hiệu đoạn gen EBNA-2/250 với nguồn ADN của EBV tách bằng Virus Magnet Nano Kit
Đƣờng chạy (-): chứng âm
Đƣờng chạy (+): chứng dƣơng với khuôn là ADN plasmid EBNA-2/250
Đƣờng chạy 1: khuôn ADN tách từ mẫu bệnh phẩm nhiễm EBV bằng bộ kít Virus Magnet Nano Kit
Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen EBNA-2/250 thể hiện trên hình 3.12 cho thấy trên đƣờng chạy số 1 với khuôn là ADN EBV tách bằng bộ kít Virus Magnet Nano Kit cho kết quả duy nhất một băng ADN có kích thƣớc khoảng 250 bp, trùng với băng ADN trên đƣờng chạy của đối chứng dƣơng là khuôn ADN plasmid EBNA-2/250, còn đƣờng chạy đối chứng âm không có băng ADN. Từ kết quả trên cho phép chúng tôi kết luận đã tách chiết đƣợc ADN EBV bằng bộ kít Virus Magnet Nano Kit.
3.4. ĐÁNH GIÁ ĐỘ CHÍNH XÁC CỦA BỘ KÍT VIRUS MAGNET NANO KIT VỚI HAI BỘ KÍT THƢƠNG MẠI BẰNG PCR
Chúng tôi đã tiến hành tách chiết đồng thời ADN của 40 mẫu huyết thanh (30 mẫu của bệnh nhân có xét nghiệm kháng thể IgG kháng VCA EBV dƣơng tính và 10 mẫu của bệnh nhân đƣợc chuẩn đoán là ung thƣ vòm họng) bằng bộ kít tự chế tạo Virus Magnet Nano Kit và hai bộ kít thƣơng mại chuyên dùng cho tách ADN/ARN của virus là MinElute® Virus Spin Kit của hãng Qiagen, Dynabeads
Myone SILANE®của Invitrogen trong cùng các điều kiện thí nghiệm. ADN của các
mẫu bệnh phẩm thu đƣợc sau khi tách chiết bằng ba bộ kít trên đƣợc dùng làm khuôn cho phản ứng PCR để bƣớc đầu so sánh định tính khả năng tách chiết ADN EBV của cả ba kít trên bằng độ đậm nhạt của sản phẩm PCR đoạn gen EBNA-2/250. Kết quả thực tế chỉ có 2 mẫu ADN tách chiết từ các mẫu máu nghi nhiễm EBV cho băng điện di sản phẩm PCR với kích thƣớc 250 nên chúng tôi chỉ lấy một kết quả điện di này làm đại diện.
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 63 Khãa 2009 - 2011
Hình 3.13: Kết quả điện di sản phẩm PCR đặc hiệu cho EBNA-2/250 dùng khuôn ADN EBV từ mẫu bệnh phẩm tách bằng Virus Magnet Nano kit (A),
MinElute® Spin Virus Kit (B), Dynabead myone Silane® Kit (C)
Đƣờng chạy (+): khuôn là ADN plasmid EBNA-2/250 M: Thang chuẩn ADN 1 kb
Đƣờng chạy (-): chứng âm
Đƣờng chạy 1-10: khuôn là 5 µl ADN tách từ các mẫu bệnh phẩm 1-10 Trên hình 3.13 thể hiện kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy, ở đƣờng
(+) M (-) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A bp 500 250 B C 500 250 500 250 250 250 250
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 64 Khãa 2009 - 2011
chạy của đối chứng âm không có khuôn nên không cho băng sản phẩm PCR, còn đƣờng chạy chứng dƣơng với khuôn là ADN plasmid chứa đoạn gen EBNA-2/250 có băng ADN kích thƣớc 250 bp, các đƣờng chạy 7, 10 tƣơng ứng với khuôn là ADN tách chiết từ mẫu số 7 của bệnh nhân Nguyễn Ngọc D (bệnh nhân đƣợc chẩn đoán ung thƣ vòm họng) do bệnh viện quân y 103 cung cấp và Nguyễn Văn Đ (bệnh nhân có kết quả IgG-VCA EBV dƣơng tính) do khoa vi sinh bệnh viện Bạch Mai cung cấp xuất hiện băng ADN có kích thƣớc 250 bp trùng với kích thƣớc băng ADN ở đối chứng dƣơng ở cả ba bản điện di ứng với ba bộ kít, chỉ khác nhau về độ đậm nhạt của băng điện di.
Điều này cho thấy với nguồn ADN của 40 mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân xét nghiệm EBV với cả ba kit cần so sánh đều phát hiện đƣợc tỷ lệ 2 mẫu dƣơng tính trên tổng 40 mẫu bằng phƣơng pháp PCR và độ đậm của băng ADN của đƣờng chạy 7, 10 từ sản phẩm PCR với nguồn ADN EBV tách bởi bộ kít MinElute® Virus Spin kit sáng nhất sau đó đến Virus Magnet Nano Kit cuối cùng là Dynabeads
Myone SILANE®. Với kết quả trên cho phép chúng tôi kết luận là cả ba bộ kít:
Virus Magnet Nano Kit, MinElute® Virus Spin kit, Dynabeads Myone SILANE®
đều có độ chính xác nhƣ nhau trong phát hiện EBV định tính bằng phƣơng pháp PCR.
3.5. SO SÁNH KHẢ NĂNG TÁCH CHIẾT ADN EBV CỦA VIRUS MAGNET NANO KIT VỚI HAI BỘ KÍT THƢƠNG MẠI BẰNG REAL-TIME PCR
Nhƣợc điểm của phản ứng PCR là chỉ đánh giá đƣợc định tính (độ chính xác) về khả năng tách chiết ADN EBV tức là chỉ xác định đƣợc bao nhiêu mẫu dƣơng tính trên tổng số mẫu xét nghiệm và phƣơng pháp này không cụ thể hóa đƣợc số bản sao của EBV trong các mẫu bệnh phẩm. Phƣơng pháp real - time PCR với các ƣu điểm nhanh, độ nhạy và độ chính xác cao, đƣợc sử dụng để định lƣợng và so sánh khả năng tách chiết ADN EBV của Virus Magnet Nano Kit (hạt nano từ bọc
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 65 Khãa 2009 - 2011
silica và bộ đệm kèm theo) với hai bộ kít thƣơng mại thể hiện bằng số bản sao ADN EBV mà các bộ kít tách đƣợc. Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen EBV-74 đã nhân dòng đƣợc ở mục 3.2.2 làm chứng dƣơng và chất chuẩn (standard) cho phản ứng Real-time PCR định lƣợng. Số lƣợng bản sao ADN EBV trong mẫu tách chiết bằng các bộ kít đƣợc định lƣợng theo khuôn chuẩn (standard). Mỗi phản ứng chúng tôi sử dụng 5µl ADN EBV khuôn.
Với thành phần phản ứng và chu trình nhiệt cho phản ứng Real-time PCR đã trình bày trong mục 2.2.6 chúng tôi thu đƣợc kết quả chạy Real-time PCR nhƣ sau: