Một khuẩn lạc đƣợc cấy vào 2 ml LB lỏng có bổ sung ampicillin 50 g/ml và đƣợc nuôi lắc qua đêm ở 370
C, 180 v/p, 14-16 giờ. Dịch nuôi cấy đƣợc ly tâm với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 10 phút để thu tế bào. Sau đó, tế bào đƣợc hoà trở lại trong 300 l đệm P1 (Tris-Cl 50 mM pH 8,0; EDTA 10 mM) có chứa RNase A 100 g/ml, trộn đều bằng vortex. Tiếp đó 300 l đệm P2 (NaOH 200 mM, 1% SDS) đƣợc bổ sung vào hỗn hợp trên, đảo nhẹ 4-6 lần và đặt ở nhiệt độ phòng 5 phút để phá vỡ tế bào giải phóng plasmid. Hỗn hợp đƣợc trung hoà bằng 300 l đệm P3 (đệm acetate 3 M pH 5,5) đã đƣợc làm lạnh, đảo nhẹ 4-6 lần, đặt trên đá 5 phút. Dịch nổi đƣợc thu lại bằng ly tâm 13000 v/p trong 10 phút và đƣợc chuyển lên cột
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 45 Khãa 2009 - 2011
Qiagen để chảy xuống tự nhiên bằng trọng lực. Cột Qiagen đƣợc rửa 4 lần, mỗi lần đều với 1ml đệm QC (NaCl 1,25 M; MOPS 50 mM pH 7,0; isopropanol 15%). Sau đó ADN bám trên cột đƣợc thu lại bằng cách bổ sung 0,8 ml đệm QF (NaCl 1,25 M; Tris-Cl 50 mM pH 8,5; isopropanol 15%).
ADN đƣợc tủa bằng cách bổ sung 0,7 lần thể tích isopropanol ở nhiệt độ phòng (tức là với 0,8 ml dịch mẫu thì bổ sung 0,56 ml isopropanol), ly tâm ngay ở 13.000 vòng/phút trong 30 phút để loại bỏ dịch nổi. Sau đó ADN đƣợc rửa với 1 ml ethanol 70%, đƣợc ly tâm lại và loại bỏ dịch nổi. Kết tủa đƣợc để khô ngoài không khí rồi đƣợc hòa tan trong 30 µl H2O. Sản phẩm tách plasmid đƣợc kiểm tra độ tinh sạch bằng điện di trên gel agarose 1%.