PCR và một chu trình nhiệt duy nhất
bp 300 200 100 M 1 2 250
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 50 Khãa 2009 - 2011
Nhƣợc điểm của phản ứng nested PCR với hai lần chạy PCR độc lập ở mục 3.1.1 là phải thực hiện phản ứng PCR hai lần, sản phẩm PCR lần 1 làm khuôn cho phản ứng PCR lần 2 mới nhân bản đƣợc đoạn gen EBNA-2/250 mong muốn. Điều này làm mất rất nhiều thời gian, hóa chất, tốn công và không thực hiện đƣợc phản ứng Real- time PCR. Nên chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu tối ƣu hóa lƣợng khuôn, lƣợng mồi, chu trình nhiệt để gộp các phản ứng trong PCR ở mục 3.1.1 thành một phản ứng với một chu trình nhiệt duy nhất. Tuy nhiên, sản phẩm PCR vẫn xuất hiện nhiều băng ADN phụ. Do đó, chúng tôi đã tiến hành thiết lại cặp mồi PCR lần một để nâng nhiệt độ gắn mồi của phản ứng này lên hơn 600C, cụ thể thêm 3 nucleotid ở đầu 5’ của mồi xuôi EBVex Fw và 4 nucleotid ở đầu 5’ của mồi ngƣợc EBVex Rv tạo cặp mồi mới cho PCR lần một là EBVex2 Fw, EBVex2 Rv với trình tự và nhiệt độ gắn mồi đƣợc trình bày chi tiết trong bảng 3.1.
Bảng 3.1: Trình tự cặp mồi EBVex 2 Fw/Rv và EBVex Fw/Rv
Tên mồi Trình tự mồi Nhiệt độ gắn
mồi (Tm)
EBVex Fw 5’-tggaaacccgtcactctc-3’ 540C
EBVex Rv 5’-AATGGCATAGGTGGAATG-3’
EBVex2 Fw 5’-tgttggaaacccgtcactctc-3’ 620C
EBVex2 Rv 5’-GGGTAATGGCATAGGTGGAATG-3’
Với sự thay đổi nhƣ trên chúng tôi nhận đƣợc nhiệt độ gắn mồi của cặp mồi dùng trong phản ứng PCR lần 1 mới lớn hơn 600
C, nhiệt độ gắn mồi này giúp chúng tôi nâng đƣợc điều kiện gắn mồi cho PCR lần một lên trên 600C để loại bỏ các đoạn sản phẩm ADN nhân lên không đặc hiệu khi trộn cả 2 cặp mồi của nested PCR hai lần PCR độc lập trong 1 phản ứng. Tiếp theo chúng tôi tiến hành tối ƣu hóa nồng độ mồi, nồng độ khuôn ADN, chu kỳ nhiệt của phản ứng nested PCR một lần.
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 51 Khãa 2009 - 2011
Sau các thí nghiệm chúng tôi nhận đƣợc chu trình nhiệt và điều kiện tối ƣu cho nested PCR một lần với một chu trình nhiệt duy nhất nhƣ sau:
Các thành phần của phản ứng Thể tích
- Đệm Taq ADN polymerase 10x 2,5 µl
- Taq ADN polymerase 5 unit/ µl 0,5 µl
- dNTPs 2,5 mM 2,5 µl - EBVex 2 Fw 5 pmol 1 µl - EBVex 2 Rv 5 pmol 1 µl - EBV Fw in 10 pmol 1 µl - EBV Rv in 10 pmol 1 µl - H2O cất khử trùng, khử ion 10, 5 µl - ADN khuôn 5 µl - Tổng thể tích phản ứng 12 µl Chu kỳ nhiệt 5 chu kỳ đầu 940C – 1 phút 30 chu kỳ sau 940C – 30 giây 600C – 1 phút 540C – 1 phút 720C – 2 phút 720C – 1 phút
Với chu trình nhiệt và thành phần phản ứng nhƣ trên chúng tôi thu đƣợc kết quả nested PCR mới (hình 3.2).
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 52 Khãa 2009 - 2011
Hình 3.2: Kết quả điện di sản phẩm nested PCR với các điều kiện tối ƣu đặc hiệu cho gen EBNA-2/250
Đƣờng chạy M: Thang ADN chuẩn 100 bp
Đƣờng chạy (-): 5 µl H2O
Đƣờng chạy 1, 2: 5 µl ADN EBV tinh sạch
Từ kết quả điện di trên hình 3.2 ta thấy trên đƣờng chạy số 1 và 2 chỉ xuất hiện duy nhất một băng ADN duy nhất có kích thƣớc khoảng 250 bp trùng với kích thƣớc dự đoán lý thuyết của đoạn gen EBNA-2/250, còn đƣờng chạy đối chứng âm không xuất hiện băng ADN nào. Do vậy chúng tôi có thể kết luận đã tối ƣu hóa đƣợc điều kiện phản ứng và thiết kế mồi thành công cặp mồi EBVex2 Fw/Rv cho phản ứng nested PCR một lần phản ứng và một chu trình nhiệt duy nhất. Sản phẩm nested PCR với cặp mồi mới nhân bản đặc hiệu cho đoạn gen EBNA-2 kích thƣớc 250 bp sau đó đã đƣợc chúng tôi nhân dòng để dùng làm đối chứng dƣơng hay mẫu chuẩn dùng cho phân tích định tính và định lƣợng EBV ở những thí nghiệm tiếp theo.
M (-) 1 2 300 200 100 250 bp
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 53 Khãa 2009 - 2011