Tƣơng tự nhƣ phần nhân dòng đoạn gen EBNA-2/250 mục 3.1. Trong phần chọn dòng tế bào mang vector tái tổ hợp chứa đoạn gen EBV- 74, 2 plasmid tách từ các khuẩn lạc trắng đƣợc PCR với cặp mồi EBV Fw3/Rv3 để kiểm tra đoạn gen cần nhân dòng EBV-74 trong các plasmid tái tổ hợp thu đƣợc.
Hình 3.10: Kết quả điện di sản phẩm PCR chọn lọc khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen EBV-74
Đƣờng chạy M: Thang ADN chuẩn 100
75 50
bp M (-) (+) 1 2
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 60 Khãa 2009 - 2011
Đƣờng chạy (-): chứng âm Đƣờng chạy (+): 5 µl ADN EBV
Đƣờng chạy 1-2: ADN plasmid tách từ 2 khuẩn lạc trắng
Kết quả điện di thể hiện trên hình 3.10 cho thấy trên đƣờng chạy 1 và 2 đều xuất hiện băng ADN sản phẩm PCR kích thƣớc khoảng 74 bp, trùng với kết quả điện di sản phẩm PCR của đối chứng dƣơng là ADN EBV trong khi đó ở đƣờng chạy của đối chứng âm không xuất hiện băng ADN nào. Điều này cho thấy chúng tôi đã nhân dòng đƣợc đoạn gen EBV-74 vào vector pGEM-T, các plasmid tái tổ hợp tách chiết từ 2 dòng khuẩn lạc trắng đều mang đoạn gen EBV-74.
Plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen EBV-74 đƣợc dùng làm đối chứng dƣơng và chất chuẩn cho các phản ứng định lƣợng ADN EBV bằng Real- time PCR trong phần so sánh khả năng tách chiết axit nucleic của bộ kít Virus Magnet Nano Kit.
3.3. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT ADN EBV BẰNG BỘ KÍT TỰ CHẾ TẠO VIRUS
MAGNET NANO KIT
Chúng tôi nghiên cứu thử nghiệm khả năng tách chiết ADN EBV trong mẫu máu của bệnh nhân nhiễm EBV bằng bộ kít tự chế tạo Virus Magnet Nano Kit bao gồm hạt từ nano bọc silica (MagSi nano) và bộ đệm kèm theo.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tìm ra đƣợc điều kiện, quy trình thích hợp cho sử dụng hạt MagSi nano để tinh sạch ADN của EBV.
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 61 Khãa 2009 - 2011
Hình 3.11: Hình ảnh bộ kít Virus Magnet Nano Kit và thao tác tách chiết axit nucleic khi sử dụng bộ kít.
Quy trình tách chiết ADN EBV bao gồm các bƣớc từ xử lý hạt MagSi nano cho tới bƣớc ly giải virus, gắn kết ADN/ARN với hạt MagSi nano, rửa sạch để loại bỏ các tạp chất ra khỏi phức hệ ADN-MagSi nano và cuối cùng là tách thu đƣợc ADN tinh sạch. Đặc biệt trong qui trình này chúng tôi không sử dụng máy ly tâm và dùng nam châm để thao tác, điều này giảm thời gian và chi phí cho tách chiết ADN. Muối GuCNS trong đệm ly giải có vai trò quan trọng trong: phá màng tế bào, virus, ức chế các nuclease, là cầu nối liên kết giữa hạt silica với axit nucleic.
Chi tiết về các khâu tinh sạch đã đƣợc tối ƣu hóa của quy trình đƣợc trình bày ở mục 2.2.1.3
Sử dụng 5 µl ADN EBV tách chiết theo bộ kít Virus Magnet Nano Kit với mẫu bệnh phẩm là huyết thanh bệnh nhân đƣợc chẩn đoán nhiễm EBV đƣợc kiểm tra bằng PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho EBV.
bp 300 200 100 250 (-) M (+) 1
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 62 Khãa 2009 - 2011
Hình 3.12: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đặc hiệu đoạn gen EBNA-2/250 với nguồn ADN của EBV tách bằng Virus Magnet Nano Kit
Đƣờng chạy (-): chứng âm
Đƣờng chạy (+): chứng dƣơng với khuôn là ADN plasmid EBNA-2/250
Đƣờng chạy 1: khuôn ADN tách từ mẫu bệnh phẩm nhiễm EBV bằng bộ kít Virus Magnet Nano Kit
Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen EBNA-2/250 thể hiện trên hình 3.12 cho thấy trên đƣờng chạy số 1 với khuôn là ADN EBV tách bằng bộ kít Virus Magnet Nano Kit cho kết quả duy nhất một băng ADN có kích thƣớc khoảng 250 bp, trùng với băng ADN trên đƣờng chạy của đối chứng dƣơng là khuôn ADN plasmid EBNA-2/250, còn đƣờng chạy đối chứng âm không có băng ADN. Từ kết quả trên cho phép chúng tôi kết luận đã tách chiết đƣợc ADN EBV bằng bộ kít Virus Magnet Nano Kit.
3.4. ĐÁNH GIÁ ĐỘ CHÍNH XÁC CỦA BỘ KÍT VIRUS MAGNET NANO KIT VỚI HAI BỘ KÍT THƢƠNG MẠI BẰNG PCR
Chúng tôi đã tiến hành tách chiết đồng thời ADN của 40 mẫu huyết thanh (30 mẫu của bệnh nhân có xét nghiệm kháng thể IgG kháng VCA EBV dƣơng tính và 10 mẫu của bệnh nhân đƣợc chuẩn đoán là ung thƣ vòm họng) bằng bộ kít tự chế tạo Virus Magnet Nano Kit và hai bộ kít thƣơng mại chuyên dùng cho tách ADN/ARN của virus là MinElute® Virus Spin Kit của hãng Qiagen, Dynabeads
Myone SILANE®của Invitrogen trong cùng các điều kiện thí nghiệm. ADN của các
mẫu bệnh phẩm thu đƣợc sau khi tách chiết bằng ba bộ kít trên đƣợc dùng làm khuôn cho phản ứng PCR để bƣớc đầu so sánh định tính khả năng tách chiết ADN EBV của cả ba kít trên bằng độ đậm nhạt của sản phẩm PCR đoạn gen EBNA-2/250. Kết quả thực tế chỉ có 2 mẫu ADN tách chiết từ các mẫu máu nghi nhiễm EBV cho băng điện di sản phẩm PCR với kích thƣớc 250 nên chúng tôi chỉ lấy một kết quả điện di này làm đại diện.
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 63 Khãa 2009 - 2011
Hình 3.13: Kết quả điện di sản phẩm PCR đặc hiệu cho EBNA-2/250 dùng khuôn ADN EBV từ mẫu bệnh phẩm tách bằng Virus Magnet Nano kit (A),
MinElute® Spin Virus Kit (B), Dynabead myone Silane® Kit (C)
Đƣờng chạy (+): khuôn là ADN plasmid EBNA-2/250 M: Thang chuẩn ADN 1 kb
Đƣờng chạy (-): chứng âm
Đƣờng chạy 1-10: khuôn là 5 µl ADN tách từ các mẫu bệnh phẩm 1-10 Trên hình 3.13 thể hiện kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy, ở đƣờng
(+) M (-) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A bp 500 250 B C 500 250 500 250 250 250 250
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 64 Khãa 2009 - 2011
chạy của đối chứng âm không có khuôn nên không cho băng sản phẩm PCR, còn đƣờng chạy chứng dƣơng với khuôn là ADN plasmid chứa đoạn gen EBNA-2/250 có băng ADN kích thƣớc 250 bp, các đƣờng chạy 7, 10 tƣơng ứng với khuôn là ADN tách chiết từ mẫu số 7 của bệnh nhân Nguyễn Ngọc D (bệnh nhân đƣợc chẩn đoán ung thƣ vòm họng) do bệnh viện quân y 103 cung cấp và Nguyễn Văn Đ (bệnh nhân có kết quả IgG-VCA EBV dƣơng tính) do khoa vi sinh bệnh viện Bạch Mai cung cấp xuất hiện băng ADN có kích thƣớc 250 bp trùng với kích thƣớc băng ADN ở đối chứng dƣơng ở cả ba bản điện di ứng với ba bộ kít, chỉ khác nhau về độ đậm nhạt của băng điện di.
Điều này cho thấy với nguồn ADN của 40 mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân xét nghiệm EBV với cả ba kit cần so sánh đều phát hiện đƣợc tỷ lệ 2 mẫu dƣơng tính trên tổng 40 mẫu bằng phƣơng pháp PCR và độ đậm của băng ADN của đƣờng chạy 7, 10 từ sản phẩm PCR với nguồn ADN EBV tách bởi bộ kít MinElute® Virus Spin kit sáng nhất sau đó đến Virus Magnet Nano Kit cuối cùng là Dynabeads
Myone SILANE®. Với kết quả trên cho phép chúng tôi kết luận là cả ba bộ kít:
Virus Magnet Nano Kit, MinElute® Virus Spin kit, Dynabeads Myone SILANE®
đều có độ chính xác nhƣ nhau trong phát hiện EBV định tính bằng phƣơng pháp PCR.
3.5. SO SÁNH KHẢ NĂNG TÁCH CHIẾT ADN EBV CỦA VIRUS MAGNET NANO KIT VỚI HAI BỘ KÍT THƢƠNG MẠI BẰNG REAL-TIME PCR
Nhƣợc điểm của phản ứng PCR là chỉ đánh giá đƣợc định tính (độ chính xác) về khả năng tách chiết ADN EBV tức là chỉ xác định đƣợc bao nhiêu mẫu dƣơng tính trên tổng số mẫu xét nghiệm và phƣơng pháp này không cụ thể hóa đƣợc số bản sao của EBV trong các mẫu bệnh phẩm. Phƣơng pháp real - time PCR với các ƣu điểm nhanh, độ nhạy và độ chính xác cao, đƣợc sử dụng để định lƣợng và so sánh khả năng tách chiết ADN EBV của Virus Magnet Nano Kit (hạt nano từ bọc
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 65 Khãa 2009 - 2011
silica và bộ đệm kèm theo) với hai bộ kít thƣơng mại thể hiện bằng số bản sao ADN EBV mà các bộ kít tách đƣợc. Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen EBV-74 đã nhân dòng đƣợc ở mục 3.2.2 làm chứng dƣơng và chất chuẩn (standard) cho phản ứng Real-time PCR định lƣợng. Số lƣợng bản sao ADN EBV trong mẫu tách chiết bằng các bộ kít đƣợc định lƣợng theo khuôn chuẩn (standard). Mỗi phản ứng chúng tôi sử dụng 5µl ADN EBV khuôn.
Với thành phần phản ứng và chu trình nhiệt cho phản ứng Real-time PCR đã trình bày trong mục 2.2.6 chúng tôi thu đƣợc kết quả chạy Real-time PCR nhƣ sau:
Hình 3.14: Kết quả Real-time PCR với nguồn ADN EBV của hai mẫu bệnh phẩm số 7, 10 tách bằng ba bộ kít Virus Magnet Nano Kit, MinElute Virus
Spin Kit, Dynabead myone Silane® Kit và chất chuẩn
PC 108 106 107 105 104 103 A B
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 66 Khãa 2009 - 2011
A: Đồ thị biểu diễn quá trình nhân bản đoạn gen EBV-74 đặc hiệu cho EBV B: Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng dựa trên sự pha loãng nồng độ plasmid EBV-74 ban đầu, nồng độ các mẫu ADN cần so sánh, trục x biểu thị giá trị logarit số lƣợng bản copies ban đầu và các mẫu ADN, trục y biểu diễn giá trị chu kỳ ngƣỡng (CT)
Kết quả Real-time PCR định lƣợng thể hiện trên hình 3.14 có hệ số tƣơng quan R2= 0.996 cho thấy đƣờng chuẩn xây dựng đƣợc từ chất chuẩn ADN plasmid mang đoạn gen EBV-74 với dải nồng 103 đến 108
copies/ml trong thí nghiệm có độ tin cậy cao đủ tiêu chuẩn cho việc định lƣợng số copies ADN EBV tách bằng ba bộ kít cần so sánh. Kết quả định lƣợng nồng độ ADN EBV tách đƣợc bằng ba bộ kít đƣợc cụ thể trong bảng 3.2.
Bảng 3.2: Kết quả real–time PCR định lƣợng ADN EBV tách bằng ba bộ kít
Mẫu CT (chu kỳ ngƣỡng) Số copies/ml
M7 Q 35.6 9,64x103 M7 Mgsi 36.2 7,17x103 M7 I 40.62 6,53x102 M10 Q 25,96 1.84x106 M10 Mgsi 26,78 1.18x106 M10 I 27,73 7.04x105
Kết quả Real-time PCR định lƣợng đối với các mẫu ADN EBV tách từ mẫu bệnh phẩm số 7 (kí hiệu: M7 Q, M7 Mgsi, M7 I) và số 10 (kí hiệu: M10 Q, M10 Mgsi, M10 I) trong đó lần lƣợt các ký hiệu Q, Mgsi, I tƣơng ứng với các kít
MinElute® Virus Spin Kit, Virus Magnet Nano Kit, Dynabead myone Silane® kit. Từ kết quả real-time PCR trên ta thấy số bản sao ADN EBV tách theo bộ kít
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 67 Khãa 2009 - 2011
Virus Magnet Nano Kit của cả hai mẫu 7 và 10 tƣơng ứng M7 Mgsi =7.17x103, M10 Mgsi = 1.18x106 copies/ml cao hơn lƣợng ADN EBV của hai mẫu này tách bằng bộ kít Dynabead Myone Silane® của Invitrogen (M7I = 6,53x102, M10I = 7.04x105) và thấp hơn lƣợng ADN EBV tách bằng MinElute® Virus Spin Kit của Qiagen (M7Q = 9.64x103, M10Q = 1.84x106). Kết quả này hoàn toàn phù hợp với độ đậm của băng điện di sản phẩm PCR đã đƣợc phân tích trong mục kết quả 3.4.
Với các kết quả thu đƣợc cho phép chúng tôi khẳng định đã tách chiết đƣợc ADN EBV bằng bộ kít Virus Magnet Nano Kit (bao gồm hạt từ bọc silica với bộ đệm kèm theo) với chất lƣợng đủ tiêu chuẩn dùng trong chẩn đoán EBV. Vấn đề đặt ra cần tiếp tục nghiên cứu là nâng cao chất lƣơng, độ ổn định của hạt từ bọc silica (hạt từ nano đƣợc chức năng hóa bề mặt) và bộ đệm kèm theo để có thể đƣa vào ứng dụng trong các chẩn đoán và phát hiện nhiễm EBV hỗ trợ cho công tác chẩn đoán, điều trị và tiên lƣợng các bệnh liên quan đến EBV.
KẾT LUẬN VÀ HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
KẾT LUẬN
Từ những kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi rút ra đƣợc những kết luận nhƣ sau:
1. Xây dựng phƣơng pháp phát hiện định tính và định lƣợng EBV bằng PCR và Real-time PCR
i). Nhân bản thành công đoạn gen EBNA-2 kích thƣớc 250 bp đặc hiệu dùng cho chẩn đoán EBV bằng nested PCR. Thiết kế thành công cặp mồi EBVex2 Fw/Rv và tối ƣu điều kiện phản ứng nested PCR một lần phản ứng với một chu trình nhiệt duy nhất. Chế độ nhiệt cho phản ứng PCR này: Vòng một với 5 chu kỳ 940C trong 1 phút, 600C trong 1 phút, 720C trong 2 phút; vòng 2 với 30 chu kỳ 940
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 68 Khãa 2009 - 2011
540C - 1 phút, 720C - 1 phút. Nhân dòng đƣợc đoạn gen EBNA-2/250 tạo chứng dƣơng cho các phản ứng phát hiện EBV bằng PCR.
ii). Đã nhân dòng thành công đoạn gen mã hóa cho protein màng BRNF1 p143 không chứa nhóm glycosyl đặc hiệu cho EBV kích thƣớc 74 bp (EBV-74) dùng cho chẩn đoán EBV bằng Real-time PCR.
2. Đã tách chiết đƣợc ADN EBV bằng hạt từ nano đƣợc chức năng hóa bề mặt (hay còn gọi là hạt Magsi nano) và có thể sử dụng trong phát hiện EBV bằng phản ứng PCR, Real-time PCR.
3. Bộ kít Virus Magnet Nano Kit cho phép tinh sạch ADN EBV (M7Mgsi = 7.17x103 copies/ml) gần tƣơng đƣơng với bộ kít MinElute® Virus Spin Kit của hãng Qiagen (M7Q = 9.64x103 copies/ml) và Dynabead myone Silane®của hãng Invitrogen (M7I = 6.53x102 copies/ml).
HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
1. Tiếp tục thử nghiệm khả năng tách chiết ADN EBV của hạt từ nano đƣợc chức năng hóa bề mặt (hạt từ bọc silica-Magsi nano) trên các mẫu bệnh phẩm nhiễm EBV.
2. Nghiên cứu độ bền của hạt từ bọc silica và bộ đệm kèm theo.
3. Phối hợp với các phòng xét nghiệm của các bệnh viện để thử nghiệm ứng dụng hạt từ nano bọc silica và bộ đệm kèm trong chẩn đoán các bệnh liên quan đến EBV.
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 69 Khãa 2009 - 2011
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Đái Duy Ban (2002), Sinh học phân tử của ung thư vòm họng, NXB Khoa học và kỹ thuật.
2. Hồ Quỳnh Thùy Dƣơng (2000), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục, Hà Nội. 3. Nguyễn Hữu Đức, Nguyễn Hoàng Hải, Trần Mậu Danh, “Chế tạo và ứng
dụng hạt nano từ bọc silica trong Y – Sinh học”, Báo cáo Hội nghị Vật lý toàn quốc lần thứ VI, Hà Nội ngày 23-25 tháng 11 năm 2005.
4. Phạm Hùng Vân (2009), PCR và real-time PCR Các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường gặp, NXB Y học.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
5. Bajij BG., Murakami M., Robertson ES. (2007) “Molecular biology of EBV on the lationship to AIDS-assosiated oncogenesis”, Cancer Treat Res. 133: 141-62.
6. Bhushan B. (2004), HADNbook of Nanotechnology, Spinger – Verlag, Berlin, Germany, 279-371.
7. Boom R., Sol C. J. A., Salimans M. M. M., Jansen C. L., Wertheim P. M. E. (1990), “Rapid ADN simple method for purification of nucleic acids”, J. Clinic. Microbiol. 28: 495-503.
8.Boom R., Sol C. J. A., Salimans M. M. M., Jansen C. L., Wertheim P. M. E. (1990), “Rapid ADN simple method for purification of nucleic acids”, J. Clinic. Microbiol. 28: 495-503.
9. Boom R., Sol C., Beld M., Weel J., Goudsmit J. ADN Dillen P. W. V. (1999), “Improved Silica-Guanidiniumthiocyanate ADN Isolation Procedure Based
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 70 Khãa 2009 - 2011
on Selective Binding of Bovine Alpha-Casein to Silica Particles”, J. Clinic. Microbiol. 37: 615-619.
10. Chang ET., Adami HO. (2006), “The enigmatic epidemiology of nasopharylgeal carcinoma”, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 15: 1765-77.
11. Chou J., Lin YC., Kim J., You L., Xu Z., He B., Jablons DM. (2008), “Nasopharyngeal carcinoma- Review of the molecular mechanisms of tumorigenesis”.
12. Clark D. (2005), Molecular Biology: UnderstADNing Genetic Revolution,
Elsevier Academic Press, California, USA, 567-599.
13. Cohen JI. (2006), “Virology ADN molecular biology of Epstein barr virus”, 21-37 .
14.Elisabeth S., Aravind P. (2007), BioNanotechnology 1st edit., Morgan & Claypool , Conecticut, USA, 31-79.
15. Epstein MA., Barr YM. ADN Achong BG. (1964), “Virus particles in cultured lymphoblastsfromBurkitt's lymphoma’’, The Lancet 1: 702-703.
16. Gerstein S. A. (2001), Molecular Biology Problem Solver, Wiley- Liss Inc, New York, USA, 167-197.
17. Guo XC., Scott K., Liu Y., Dean M., David V., Nelson GW., Johnson RC.,