LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 38 Khãa 2009 - 2011
- Dụng cụ kèm theo: pipet đa kênh, giá từ dùng cho tách chiết từng mẫu là loại có mã code ADZ 5410, tách chiết cùng một lúc 96 mẫu có mã code AVG 81511 của hãng Promega.
Quá trình tách chiết axit nucleic bằng bộ kít Virus Magnet Nano Kit bao gồm các giai đoạn sau:
Giai đoạn 1: Xử lý hạt MagSi nano
1. Dung dịch chứa hạt MagSi nano (nồng độ 10 mg/ml) đƣợc lắc đều và đem siêu âm trong thời gian 5-10 phút để các hạt đƣợc phân bố một cách đồng đều và không bị kết tụ với nhau trong dịch lỏng.
2. Tiếp theo, 1 ml dịch hạt MagSi nano đƣợc lấy vào ống eppendorf 1, 5 ml. Đặt lên nam châm tập trung hạt từ trong thời gian 2-3 phút, hoặc cho tới khi dịch trong.
3. Bổ sung 1 ml nƣớc cất, huyền dịch đều bằng cách pipet lên xuống nhiều lần. Đặt lên nam châm tập trung hạt từ với thời gian 2-3 phút. Hút bỏ dịch nổi. Lặp lại bƣớc này 2-3 lần.
4. Cuối cùng, 1ml nƣớc cất khử trùng đƣợc thêm vào. Bảo quản ở 40C.
Giai đoạn 2: Tinh sạch ADN/ARN từ mẫu bệnh phẩm bằng hạt Mag Si nano
Virus Magnet Nano kít
MagSi Nano (20mg/ml) Bộ đệm Đệm ly giải 5,25 M GuSCN; 50 mM Tris-HCl pH 7; 20mM EDTA pH 8,0; 20 mM NaCl Đệm rửa 1 2,2 M GuSCN; 21 mM Tris-HCl pH 7; 56% EtOH Đệm rửa 2 EtOH 70%
Đệm chiết đẩy ADN
1mM EDTA pH 8,0; 10 mM Tris-HCl
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 39 Khãa 2009 - 2011
1. Đầu tiên, 20 l Protease K đƣợc lấy vào ống eppendorf 1, 5 ml sạch. 2. Tiếp theo, 200 l mẫu bệnh phẩm đƣợc thêm vào.
3. Thêm 1 ml Lysis Buffer (có bổ sung ARN carrier). Huyền dịch đều dung dịch bằng cách pipet 4-6 lần. Đặt ống ở 56-600C trong 10 phút.
4. Thêm 200 l ethanol 960. Sau đó, 200 l hạt MagSi nano cũng đƣợc thêm vào. Huyền dịch đều dung dịch bằng pipet 4-6 lần, đảo ngƣợc ống lên xuống 3-5 lần và đặt ở nhiệt độ phòng 10 phút.
5. Đặt ống lên nam châm tập trung hạt từ 2-3 phút hoặc cho tới khi dịch trở nên trong. Đổ bỏ dịch nổi. Nếu dịch lỏng vẫn còn trong ống, hút bỏ bằng pipet.
6. Bỏ ống ra khỏi nam châm, bổ sung 500 l đệm rửa 1 (Washing buffer 1). Trộn đều bằng cách pipet 4-6 lần.
7. Lặp lại bƣớc 5.
8. Bỏ ống ra khỏi nam châm, bổ sung 500 l đệm rửa 2 (Washing Buffer 2). Trộn đều bằng pipet 4-6 lần và chuyển sang ống eppendorf 1, 5 ml mới.
9. Lặp lại bƣớc 7.
10. Bỏ ống ra khỏi nam châm, bổ sung 500 l ethanol 960. Trộn đều bằng cách pipet 4-6 lần.
11. Lặp lại bƣớc 9. Ethanol cần đƣợc loại bỏ ra khỏi hạt MagSi nano một cách hoàn toàn bằng cách mở nắp ống và đặt ở 600C trong 3-5 phút.
12. Bổ sung 100 l đệm chiết đẩy (Elution buffer). Trộn đều bằng pipet 4-6 lần và đặt ở nhiệt độ phòng 5-7 phút. Tiếp theo, đặt lên 600C trong 3-5 phút.
13. Đặt ống lên nam châm tập trung hạt từ 2-3 phút hoặc cho tới khi dịch trở nên trong. Hút chuyển dịch trong (có chứa axít nucleic) sang ống eppendorf mới. Bảo quản ở -200C.