Mỗi phản ứng PCR cơ bản thể tích 25 µl chứa các thành phần dƣới đây:
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 40 Khãa 2009 - 2011
- Taq ADN polymerase (5 unit/µl) 0,5 µl
- Hỗn hợp dNTP (2 mM) 2,5 µl
- ADN khuôn 3 µl
- Mồi xuôi (10 pmol) 1 µl
- Mồi ngƣợc (10 pmol) 1 µl
- H2O cất khử trùng, khử ion 14,5 µl
- Tổng thể tích phản ứng 25 µl
Hỗn hợp PCR đƣợc trộn đều và đặt vào máy PCR. Chu trình nhiệt đƣợc điều chỉnh cẩn thận về nhiệt độ ủ, thời gian ủ và thời gian kéo dài sao cho phù hợp. Sử dụng nƣớc cất 2 lần là đối chứng âm tính.
2.2.2.1. Nhân bản đặc hiệu đoạn gen EBNA-2/250
Trong nghiên cứu này đầu tiên chúng tôi sử dụng nested PCR gồm hai lần PCR độc lập, PCR lần 2 sử dụng sản phẩm PCR lần 1 làm khuôn để nhân đoạn gen EBNA-2 kích thƣớc 250 bp theo công bố của Van B. D. và cs năm 2010 [32]. Các thành phần và điều kiện phản ứng của PCR hai lần độc lập nhƣ sau:
PCR lần 1
Các thành phần của phản ứng Thể tích
- Đệm Taq ADN polymerase 10x 2,5 µl
- Taq ADN polymerase 5 unit/ µl 0,5 µl
- Hỗn hợp dNTPs 2,5 mM 2,5 µl
- EBV ex-Fw 10 pmol 1 µl
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 41 Khãa 2009 - 2011
- H2O cất khử trùng, khử ion 12, 5 µl
- ADN khuôn 5 µl
- Tổng thể tích phản ứng 25 µl
Chu trình nhiệt
25 chu trình
Giai đoạn biến tính 940C – 1phút Giai đoạn gắn mồi 520
C – 45 giây Giai đoạn kéo dài 720C – 1 phút
PCR lần 2
Các thành phần của phản ứng Thể tích
- Đệm Taq ADN polymerase 10x 2,5 µl
- Taq ADN polymerase 5 unit/ µl 0,5 µl
- Hỗn hợp dNTPs 2,5 mM 2,5 µl - EBV-Fw in 10 pmol 1 µl - EBV-Rv in 10 pmol 1 µl - H2O cất khử trùng, khử ion 2, 5 µl - Sản phẩm PCR I làm khuôn 10 µl - Tổng thể tích phản ứng 25 µl Chu trình nhiệt 30 chu trình
Giai đoạn biến tính 940C – 30 giây Giai đoạn gắn mồi 540
C – 1 phút Giai đoạn kéo dài 720C – 1 phút
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 42 Khãa 2009 - 2011
Vì phản ứng PCR phải thực hiện qua hai lần độc lập nhƣ trên nên rất tốn thời gian, hóa chất, hạn chế việc ứng dụng của phƣơng pháp này trong việc phát hiện định tính bằng PCR và không thực hiện đƣợc phản ứng real-time PCR. Do đó, thách thức của chúng tôi trong nghiên cứu này là phải tối ƣu hóa đƣợc các điều kiện PCR để có thể chuyển phản ứng nested PCR hai lần độc lập thành PCR một lần với một phản ứng và một chu kỳ nhiệt duy nhất để nhân bản đặc hiệu đoạn gen EBNA-2/250 sử dụng trong chẩn đoán EBV bằng PCR.
2.2.2.2 Nhân bản đặc hiệu đoạn gen EBV-74
Phản ứng PCR nhân bản đặc hiệu đoạn gen mã hóa cho protein màng BNRF1 không chứa nhóm glycosyl kích thƣớc 74 bp ( kí hiệu: EBV-74) theo công bố của Niesters HG. và cộng sự có thành phần phản ứng và chế độ nhiệt nhƣ sau:
Các thành phần của phản ứng Thể tích
- Đệm Taq ADN polymerase 10x 2,5 µl
- Taq ADN polymerase (5 unit/µl) 0,5 µl
- dNTPs (2 mM) 2,5 µl
- Mồi xuôi Fw3 (10 pmol) 1 µl
- Mồi ngƣợc Rv3 (10 pmol) 1 µl
- ADN EBV 5 µl
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 43 Khãa 2009 - 2011
- Tổng thể tích phản ứng 25 µl
Chu trình nhiệt:
30 chu trình Giai đoạn biến tính 95
0
C – 15 giây Giai đoạn gắn mồi và kéo dài 600C – 1 phút