Trong nghiên cứu này trình tự đoạn gen đặc hiệu của EBV đƣợc đọc trên hệ thống giải trình tự CEQ-8000 của Beckman Coulter. Cụ thể, phản ứng PCR đƣợc tiến hành qua hai bƣớc: i) Bƣớc PCR thông thƣờng để khuyếch đại lƣợng khuôn ban đầu của trình tự cần đọc, ii) Bƣớc PCR cho xác định trình tự. Trong đó, PCR thông thƣờng sử dụng khuôn là vector tái tổ hợp pGEM-T mang đoạn gen cần giải trình tự mang cặp mồi pUC19 Fw/Rv của vector. Sản phẩm PCR của phản ứng là đoạn ADN này có kích thƣớc bằng tổng đoạn gen nhân dòng cộng với đoạn trình tự khoảng 300 bp khoảng cách giữa cặp mồi pUC19 trên vector là 300 bp. Sản phẩm PCR sau đó đƣợc pha loãng ở nồng độ thích hợp (khoảng 50-100 pmol). Sản phẩm PCR trên đƣợc dùng làm khuôn cho phản ứng PCR xác định trình tự. Về cơ bản, phản ứng PCR này có các thành phần giống nhƣ phản ứng PCR thông thƣờng nhƣng có một số khác biệt là chỉ cần dùng một loại mồi (mồi xuôi hoặc mồi ngƣợc và sự có mặt của các ddNTP với đặc điểm thiếu một nhóm 3’-OH nên khi đƣợc enzyme Taq polymerase gắn vào chuỗi ADN đang tổng hợp thì sẽ làm dừng phản ứng tổng hợp ADN do không có nhóm 3’-OH để hình thành liên kết với nucleotit tiếp theo [2]. Nhƣ vậy từ một đoạn ADN ban đầu, nhiều sợi đơn mới đƣợc hình
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 46 Khãa 2009 - 2011
thành với độ dài ngắn khác nhau một nucleotit. Các sợi đơn mới đƣợc tổng hợp đƣợc phân tách trên gel acrylamid dạng mao quản. Máy đọc trình tự sẽ tự động đọc và đƣa ra trình tự đoạn ADN gốc. Thành phần cho phản ứng PCR cho xác định trình tự gồm: 6µl hỗn hợp DTCS (Dye terminator cycle sequencing) master mix, 1µl khuôn, 1µl mồi xuôi hoặc mồi ngƣợc, thên H2O cất vô trùng đủ thể tích 20 µl.
Phản ứng PCR đƣợc thực hiện 35 chu kỳ gồm 3 bƣớc: 960C trong 30 giây, 560C trong 30 giây, 600C trong 4 phút. Sản phẩm của phản ứng PCR này đƣợc xử lý trƣớc khi đƣa vào máy giải trình tự. Quá trình xử lý bao gồm các bƣớc sau
- Dung dịch dừng phản ứng đƣợc chuẩn bị gồm 20 l CH3COOK 3 M pH 5,2; 20 l EDTA 100 mM pH 8,0; 10 l glycogen (giữ ở -200C) và đƣợc trộn đều
- 5 l dung dịch dừng phản ứng đƣợc bổ sung vào mỗi ống sản phẩm PCR và trộn đều thật kỹ
- Tiếp theo thêm 60 l ethanol 95% (giữ ở -200C)
- Hỗn hợp phản ứng đƣợc ly tâm ngay ở 13000 v/p trong 20 phút ở 40C. Dịch nổi đƣợc hút bỏ và thu kết tủa. Kết tủa đƣợc rửa 2 lần, mỗi lần bằng 200 l ethanol 70% (giữ ở -200C) và đƣợc ly tâm ly tâm ở 13000 vòng/ phút trong 5 phút ở 40
C. Dịch nổi đƣợc hút bỏ cẩn thận bằng pipet và thu tủa. Tủa đƣợc để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng trong tủ hút vô trùng sạch sau đó đƣợc hòa tan lại bằng 40 l dung dịch SLS (Sample loading solution). Mẫu sau khi xử lý đƣợc giải trình tự bằng hệ thống giải trình tự của hãng Beckman Coulter.