3.3.1. Bố trí thí nghiệm (xem sơ đồ hình 3)
Thí nghiệm gồm ba nghiệm thức tương ứng với việc bổ sung sản phẩm Turbo- HUFA ở ba liều lượng khác nhau: 2 mL, 4 mL và 6 mL vào thức ăn công nghiệp và nghiệm thức đối chứng không bổ sung sản phẩm Turbo-HUFA (xem sơ đồ hình 3). Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, cùng lúc (để hạn chế tác động môi trường) và áp dụng chế độ chăm sóc, quản lý như nhau trong suốt quá trình thí nghiệm. Sự bố trí ở mỗi nghiệm thức như sau:
+Tôm bố mẹ nuôi tái phát dục trong bể ciment 24 m3/bể, mực nước 0,7-0,8m, giá thể là bó sợi nylon và ống nhựa được thả 50% diện tích đáy bể, trên 1/3 mặt nước phủ bèo lục bình, có 4-5 vòi sục khí hoạt động 24/24.
+Mật độ nuôi là 2 con/m2, tỷ lệ đực:cái là 1:4. +Chế độ chăm sóc quản lý:
-Điều kiện môi trường luôn theo dõi chặt chẽ, duy trì ổn định, đảm bảo các giá trị dao động trong ngưỡng chịu đựng của tôm nuôi không làm ảnh hưởng đến quá trình tái phát dục và sinh sản của tôm cái: nhiệt độ 28,7-30,4oC; pH=7,84-8,45; TAN:0,006-0,03 mg/L; Nitrite:< 0,3 mg/L.
-Cho ăn: 2 lần /ngày lúc 8h và 17h, khẩu phần thức ăn 3% khối lượng thân tôm. Thức ăn rải đều khắp bể. Dùng thức ăn công nghiệp dạng viên bổ sung sản phẩm Turbo HUFA liều lượng khác nhau ở các nghiệm thức thí nghiệm (2 mL, 4 mL hoặc 6 mL/kg thức ăn) cho ăn vào lúc 8h mỗi ngày. Thức ăn tươi được cắt nhỏ vừa cỡ mồi, cho ăn vào buổi chiều lúc 17h mỗi ngày. Nghiệm thức đối chứng cũng cho ăn như các nghiệm thức thí nghiệm nhưng không bổ sung HUFA vào thức ăn công nghiệp.
-Bể thay nước định kỳ 2 ngày/lần, lượng nước thay mỗi lần là 30-40%. Vệ sinh, thay nước hoàn toàn cho bể 14 ngày/lần và kết hợp kiểm tra tôm nuôi xác định các chỉ tiêu về sinh sản (sức sinh sản, tỷ lệ tái phát dục, số lần đẻ tái phát,...), chất lượng trứng (khối lượng ướt, đường kính trứng, tỷ lệ nở,…), chuyển tôm mang trứng đi ấp nở và đánh giá chất lượng ấu trùng (khả năng chịu đựng trong dung dịch ammonia với các nồng độ 0, 5, 10, 15, 20 ppm).
Sơ đồ thiết kế thí nghiệm (hình 12):
Hình12: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm bổ sung HUFA vào thức ăn với nồng độ khác nhau Đối chứng
THÍ NGHIỆM
Nồng độ HUFA (mL/kg thức ăn)
Đánh giá ảnh hưởng lên:
o Tỷ lệ sống, thời gian lột xác, thời gian tái phát dục, sự phát triển buồng trứng và tỷ lệ tái phát dục, tỷ lệ đẻ;
o Sức sinh sản;
o Khối lượng ướt, đường kính trứng và tỷ lệ nở của trứng; o Chất lượng ấu trùng.
ĐÁNH GIÁ VÀ KẾT LUẬN 6 ml HUFA 4 ml HUFA
2 ml HUFA
3.3.2. Phương pháp theo dõi và xác định các chỉ tiêu
Phương pháp theo dõi thời gian tái phát dục, đẻ trứng, lột xác và sự phát triển của buồng trứng tôm mẹ:
Mỗi bể đặt 3 giỏ nhựa có thả 2 con tôm cái vừa ấp nở hết trứng và chưa tái phát triển tuyến sinh dục. Các chế độ chăm sóc quản lý giống như tôm thả nuôi thí nghiệm trong bể. Định kỳ 3 ngày/lần kéo giỏ nhựa lên quan sát theo dõi sự phát triển của tuyến sinh dục ở giáp đầu ngực của tôm cái theo phương
pháp của Nguyễn Thanh Phương (2003) [8]. Khi thấy bắt đầu có tuyến sinh dục thì ghi ngày để tính thời gian tái phát dục. Sau đó, tiếp tục theo dõi đo kích thước buồng trứng và tính thời gian phát triển tương ứng với từng giai đoạn. Chiều dài buồng được đo từ điểm cuối khoang giáp đầu ngực ngược trở lên hướng chủy (thước đặt song song và đọc theo chiều mũi tên AB hình 13). Khi
tôm lột xác thì ghi thời gian để tính thời gian lột xác và khi tôm mẹ đẻ trứng thì cũng ghi thời gian đẻ trứng.
Phương pháp xác định tỷ lệ tái phát dục, tỷ lệ đẻ:
Định kỳ 14 ngày/lần rút cạn nước trong bể vệ sinh chà bể và kiểm tra số lượng tôm mang trứng và tôm tái phát dục. Tôm tái phát dục được tính bằng tổng số tôm cái mang trứng, vừa chớm hoặc đang có tuyến sinh dục ở giáp đầu ngực.
Tỷ lệ tái phát dục (%) = (số tôm tái phát dục/số tôm thí nghiệm) x100. Tỷ lệ đẻ (%)=(số tôm mang trứng/ số tôm thí nghiệm)x100.
Phương pháp đánh dấu mắt tôm:
Tôm cái đẻ ở lần đầu trong thí nghiệm sẽ cột dây nylon màu ở cuống mắt để đánh dấu lần đẻ này và màu dây ứng với các nghiệm thức là: 2 mL-dây xanh, 4 mL-dây đỏ, 6 mL-dây đen, đối chứng-dây vàng. Sau đó, ở những lần sinh sản tiếp theo, nếu tôm đã cột dây tiếp tục đẻ thì sẽ tiếp tục đánh dấu bằng sợi nylon cùng màu với lần trước. Dựa vào số dây để tính số lần đẻ/con tôm cái.
Phương pháp xác định sức sinh sản tôm mẹ:
Chọn 3 con tôm cái mang trứng màu vàng cam (hình 14) cùng màu, bụng đầy trứng ở mỗi lô đem cân khối lượng cơ thể (m1) rồi đưa vào bể ấp riêng theo từng nghiệm thức.
Đồng thời lấy 0,03 g trứng (lấy 3 mẫu ở 3 vị trí khác nhau của buồng trứng, mỗi mẫu 0,01 g) sử dụng cân có độ chính xác 0,01 g để lấy mẫu cho vào đĩa petri, dùng pipet
A B
Hình 13: Cách đo chiều dài buồng trứng tôm cái.
đư
ờng kính
B
A
Hình 15: Phương pháp đo đường kính trứng.
nhỏ vài giọt nước vào mẫu trứng đếm số trứng, lấy kết quả trung bình (N1 trứng). Sử dụng 3 cá thể cho mỗi nghiệm thức.
Sau khi trứng nở hết, đem 3 tôm mẹ trên cân lại để biết khối lượng tôm mẹ (m2) và đếm số ấu trùng (M) tương ứng. Các chỉ tiêu sức sinh sản cụ thể như sau:
♠ Sức sinh sản tuyệt đối tính bằng tổng số trứng trên một con tôm cái một lần đẻ.
♠ Sức sinh sản tương đối tính bằng số trứng trên một gam khối lượng cơ thể tôm mẹ.
♠ Sức sinh sản thực tế tính bằng số ấu trùng trên một gam khối lượng cơ thể tôm mẹ. Phương pháp đo đường kính trứng:
Lấy ngẫu nhiên 10 trứng trên 1 buồng trứng rồi đo đường kính từng trứng bằng kính hiển vi soi nổi ở độ phóng đại 20, lặp lại 3 lần và tính kết quả trung bình (hình 15).
Phương pháp xác định khối lượng ướt của trứng:
-Chọn tôm cái mang trứng đầy, trứng màu vàng cam (mới đẻ), chọn 3 con/nghiệm thức.
-Dùng kim mũi giáo tách và kéo cắt lấy 3 mẫu trứng/buồng trứng ở các vị trí khác nhau và lấy 0,01 g/mẫu trứng (dùng cân điện tử cân mẫu trứng).
-Đặt các mẫu trứng trên đĩa petri, nhỏ lên một ít nước sạch cho trứng rời nhau dùng kim tách nhẹ trứng và đếm tổng số lượng trứng ở mỗi mẫu.
-Lặp lại ba lần cách lấy mẫu và đếm trứng như trên, lấy kết quả để tính giá trị trung bình khối lượng ướt của mỗi trứng ở từng nghiệm thức.
Hình 14: Tôm cái mang trứng vàng cam (mới đẻ).
Phương pháp ấp nở và định lượng ấu trùng:
Tôm mẹ mang trứng được chuyển vào bể ấp nở riêng biệt ứng với các nghiệm thức khác nhau và được thuần hoá độ mặn dần đến 12‰. Hàng ngày kiểm tra thấy trứng tôm chuyển sang màu xám đậm (hình 16) đưa tôm ra thau nhựa 60 L tắm formalin 20-25 ppm sau 30 phút chuyển vào thùng nhựa 160 L sục khí liên tục, độ mặn 12‰,pH=7.5-8.0, nhiệt độ: 29-30oC (hình 17).
Sau 2 ngày trứng đã nở hết thành ấu trùng thì dùng vợt thu hết ấu trùng cho vào 1 lít nước lợ sạch, trộn nhẹ cho ấu trùng phân tán đều, dùng cốc thuỷ tinh 120 mL lấy mẫu 3 lần ở những vị trí khác nhau rồi đếm số ấu trùng trong mỗi mẫu, lấy kết quả trung bình và tính số ấu trùng tổng số đã thu được.
Phương pháp kiểm tra chất lượng ấu trùng [28] (trao đổi riêng):
Ấu trùng một ngày tuổi được đánh giá chất lượng bằng cách xác định nồng độ ammonia gây chết 50% số ấu trùng thí nghiệm sau 24 giờ thử (24h-LC50) (phương pháp Trimmed Spearman Karber).
Cách pha dung dịch sốc ấu trùng:
-Lấy 300 mg NaHCO3 hoà tan vào 1 L nước cất được dung dịch A.
-Lấy 2,93 g NH4Cl hoà tan vào 1 L dung dịch A được dung dịch NH4+-N 1000 ppm (dung dịch B) (coi như bằng nồng độ ammonia tổng số, kí hiệu: TAN).
Khi cần sốc ấu trùng kiểm tra chất lượng trong dung dịch ammonia nồng độ x ppm thì chỉ cần lấy x mL dung dịch B pha vào 1 L nước lợ sạch độ mặn 12‰ là được dung dịch thử có nồng độ như mong muốn.Với ấu trùng 1 ngày tuổi nồng độ TAN test là 0, 5, 10, 15, 20 ppm.
Hình 16: Tôm cái mang trứng
Cách bố trí thí nghiệm:
Các tô nhựa dung tích 600 mL được đổ 500 mL dung dịch test theo các nồng độ thử với ba lần lặp lại. Sau đó khoảng 30 phút thì bố trí vào mỗi tô 30 ấu trùng và dùng máy đo pH để ghi lại pH ban đầu. Các tô để nơi thoáng mát, nhiệt độ 29-30oC.
Sau 24 giờ kể từ khi bố trí thí nghiệm ấu trùng vào tô thì tiến hành lấy kết quả thí nghiệm bằng cách đo pH và đếm số ấu trùng chết. Ấu trùng chết là ấu trùng không còn phản ứng trước những kích thích cơ học và các phụ bộ [28]. Nếu tỷ lệ chết của ấu trùng ở nghiệm thức đối chứng (0 ppm) lớn hơn 10% thì không lấy kết quả của lần thí nghiệm đó.
3.3.3. Phương pháp thu thập, tính toán và xử lý số liệu
Các số liệu thu thập dạng số liệu sơ cấp thông qua cân, đo, đếm hoặc theo dõi, quan sát trực tiếp trên mẫu thu từ các nghiệm thức thí nghiệm và lập sổ nhật ký ghi lại, lưu giữ các số liệu này.
Các công thức tính toán các chỉ tiêu: oKhối lượng trứng
mm1 m2(mg)
oSức sinh sản tuyệt đối (tổng số trứng mà tôm cái mang)
03 , 0 1 m N N (số trứng/tôm mẹ)
oSức sinh sản tương đối (số trứng trên gam tôm mẹ)
2
m N
n (số trứng/gam tôm mẹ)
oSức sinh sản thức tế (số ấu trùng/g tôm mẹ)
oKhối lượng trứng ướt (mg)= 0,01*1000/N1
oNồng độ ammonia không phân li của Amstrong và cộng sự (1978): [NH3] (ppm) = [TAN]/(1-10(pK-pH)).
Trong đó: [NH3]: nồng độ ammonia không phân li (ppm).
[TAN]: nồng độ ammonia tổng số (ppm).
m2
M SSTT =
pK: hệ số phân li (bằng 9,31 ở độ mặn 12‰, 28oC). pH: giá trị pH trung bình, được tính như sau: pH trung bình= -lg [½ *(10-pH đầu+10-pH cuối)].
oCách xác định 24h-LC50 (Trần Thế Hoanh, 1995):
Gọi x (ppm) là nồng độ thuốc và y là tỷ lệ ấu trùng chết trung bình của 3 lần lặp lại ở thời điểm cố định là 24 giờ. Tương quan nồng độ thuốc thử và tỷ lệ chết là tương quan theo kiêu đường thẳng Y=bX+a. Trong đó, Y = Arcsin y , X = lgy. Giá trị x và y được thu thập từ thức nghiệm để tính giá trị X và Y, hệ số b và giá trị a của phương trình hồi qui được xác định thông qua mối tương quan giữa Y và X bằng phần mềm Microsolf Excel 2003.
Kết thúc thí nghiệm các số liệu sẽ được xử lý trên máy tính bằng phần mềm Microsoft Excel, tính giá trị trung bình phân tích ANOVA, tìm sự khác biệt giữa các giá trị trung bình nghiệm thức theo phép thử LSD và Paired-Samples T-test với độ tin cậy 95% bằng phần mềm SPSS (phiên bản 11,0). Các số liệu trình bày dưới dạng: giá trị trung bình sai số chuẩn (SE).
Khi y=50% Y = Arcsin 0,5 x = LC50 = 10X
Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.
4.1. Tỷ lệ sống của tôm bố mẹ nuôi vỗ tái phát dục
Qua biểu đồ hình 18 cho thấy tôm đực có sự biến động đáng kể về tỷ lệ sống so với tôm cái. Trong đó, nghiệm thức bổ sung 6 mL HUFA có tỷ lệ sống tôm đực thấp nhất (74,046,7%), nghiệm thức đối chứng cao nhất (84,44,6%). Tỷ lệ sống tôm cái tương đối cao ở tất cả các nghiệm thức, trung bình từ 89,6-94,0% với nghiệm thức bổ sung 6 mL HUFA đạt tỷ lệ sống cao nhất (94,51,8%), nghiệm thức đối chứng có tỷ lệ sống thấp nhất (89,63,6%) nhưng khác biệt không có ý nghĩa (p>0,05). Tuy nhiên, tỷ lệ sống tôm đực có liên quan với tỷ lệ tái phát dục của tôm cái có thể thấy rõ nhất ở nghiệm thức bổ sung 6 mL HUFA/kg thức ăn. Tỷ lệ tôm cái tái phát dục cao nhất (81,0%) do đó hoạt động bắt cặp giao vỹ giữa tôm đực với tôm cái diễn ra nhiều hơn các nghiệm thức có tỷ lệ tôm cái tái phát dục thấp hơn (71,9-76,2%). Và đó là nguyên nhân chủ yếu khiến tôm đực phải tăng mức độ hoạt động, tiêu hao nhiều năng lượng cho quá trình tái tạo sản phẩm sinh dục sau mỗi lần giao vỹ. Vì vậy, tôm đực có tuổi thọ và sức khỏe suy giảm, tỷ lệ chết cao nhất ứng ở các nghiệm thức có tôm cái thành thục nhiều nhất là tất yếu. Theo Nguyễn Thanh Phương (2003) cho thấy trong quần đàn tôm càng xanh nuôi trong ao thương phẩm tỷ lệ tôm đực thấp hơn tôm cái và tỷ lệ hao hụt khá cao trong giai đoạn thành thục vì đặc tính tranh giành nơi sống, ăn thịt lẫn nhau và tăng cường tham gia hoạt động sinh sản [8]. Trong thí nghiệm này cho thấy tôm đực đang ở tuổi thành thục cao (càng xanh) cũng xảy ra hiện tượng tương tự.
Hình18: Sự biến động tỷ lệ sống tôm bố mẹ trong thời gian nuôi vỗ.
0 20 40 60 80 100 2 mL 4 mL 6 mL ĐC nghiệm thức tỷ lệ sống (%) tôm cái tôm đực
4.2. Thời gian tái phát dục, thời gian đẻ trứng tần suất lột xác và sự phát triển của buồng trứng tôm cái
4.2.1. Thời gian tái phát dục
Tôm cái giả ở nghiệm thức bổ sung 6 mL HUFA có thời gian tái phát dục ngắn nhất (từ 20,4 ngày), dài nhất ở nghiệm thức đối chứng (ĐC) (5,11,5 ngày) và 2 nghiệm thức bổ sung 2 và 4 mL HUFA cũng có thời gian tái dục ngắn hơn nhưng sự khác biệt không có ý nghĩa (p>0,05) (hình 19). Các nghiệm thức được bổ sung HUFA trong thức ăn đã giúp tôm cái hấp thu đủ những chất cần thiết bù đắp vật chất đã cạn kiệt sau khi đẻ trứng và tích lũy lại vật chất mới dảm bảo cho sự tái phát triển buồng trứng. Trong quá trình nuôi vỗ tôm mẹ tái phát dục, thức ăn không chỉ có ảnh hưởng đến khả năng tích lũy noãn hoàng, sự phát triển buồng trứng mà còn ảnh hưởng đến cả chất lượng ấu trùng ở thế hệ đàn con. Dinh dưỡng kém sẽ ức chế sự tái phát triển của buồng trứng và tạo nên một thế hệ sức sống thấp, vì vậy thức ăn thích hợp cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng và dễ tiêu hóa cho tôm mẹ là rất cần thiết. Do đó, việc bổ sung HUFA đã có tác động nhất định trong việc rút ngắn thời gian tái phát dục của tôm cái giả. Thí nghiệm cho kết quả tương tự như kết quả nghiên cứu của Rodaldo (2003) đã thực nghiệm thành công trên tôm mẹ càng xanh bình thường khi bổ sung HUFA [22].
4.2.2. Thời gian đẻ trứng của tôm cái
Hình 19:Thời gian tái phát dục (TPD) của tôm cái. 3,2 2,2 2 5,1 0 1 2 3 4 5 6 2 mL 4 mL 6 mL ĐC nghiệm thức
Thời gian tái phát dục (ngà
y)
Hình 20: Thời gian đẻ trứng của tôm cái. 23,4 17,6 24 17 0 5 10 15 20 25 30 2 mL 4 mL 6 mL ĐC nghiệm thức
Thời gian một lần đẻ trứng của tôm cái ở nghiệm thức đối chứng ngắn nhất (173,1 ngày) và dài nhất là các bể cho ăn bổ sung 6 mL HUFA (244,6 ngày/lần) nhưng khác biệt không có ý nghĩa (p>0,05). Đồ thị hình 20 cho thấy thời gian đẻ trứng của tôm cái ở các nghiệm thức. Nghiệm thức bổ sung 4 mL HUFA/kg thức ăn có thời gian đẻ trứng trung bình 17,6 ngày và lột xác là 17,2 ngày, gần trùng nhau chứng tỏ hoạt động lột xác của tôm cái nghiệm thức này chủ yếu là lột xác tiền giao vỹ, rất ít xảy ra lột xác sinh trưởng. Với nồng độ bổ sung 6 mL HUFA/kg thức ăn đã cung cấp một lượng chất dinh dưỡng dồi dào làm cho sự tăng trưởng diễn ra mạnh mẽ, tôm mẹ lột xác tăng trưởng trước thời điểm buồng trứng phát triển chín muồi, làm kéo dài thời gian đẻ trứng. Khi cung cấp thức ăn đủ chất dinh dưỡng trong thời gian nuôi vỗ sẽ giúp tôm mẹ bổ sung vật chất cần thiết đã cạn kiệt sau khi đẻ trứng và tái phát triển buồng trứng, đồng thời cơ thể cũng có thể hồi phục và phát triển bình thường sau mỗi lần đẻ trứng, đảm bảo cho sự phát triển buồng trứng tốt