Sagi (1990) và Malecha (1992) nghiên cứu chuyên sâu về chức năng của tuyến đực đến sự biệt hóa giới tính cũng như đặc điểm sinh dục thứ cấp, ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng. Tuyến này nằm ở cuối ống dẫn tinh, là một dải tế bào dạng hình tháp liên kết lỏng lẻo và chịu sự ức chế của một tuyến nội tiết nằm ở cuống mắt tôm [43] [44]. Ở con đực, tuyến này kiểm soát quá trình sinh sản mà bắt đầu, hoàn thành và tập trung hoạt động sinh dục khi có sự tuần hoàn của hormone tuyến đực trong máu rồi sau đó hoạt động sinh tinh xảy ra khi tuyến đực phát triển đầy đủ [14]. Khi tuyến đực bị loại bỏ, càng tôm chậm phát triển, gai sinh dục và một số đặc điểm sinh dục phụ khác cũng tiêu biến, hệ sinh dục đực dần bị thoái hóa và giảm tốc độ tăng trưởng [9].
Với những nghiên cứu này, việc xác định độ tuổi thích hợp để loại bỏ tuyến đực ở tôm càng xanh đã được rất nhiều người quan tâm và có một số kết quả ban đầu. Trên tôm đực nhỏ, khi loại bỏ tuyến đực, hầu hết cá thể thí nghiệm đã chuyển thành tôm đực càng cam nhưng không chuyển sang kiểu hình càng xanh. Còn khi tiến hành vi phẫu tôm đực càng cam thì hầu hết chuyển sang kiểu hình càng xanh (76%) [43] [44]. Riêng thí nghiệm loại bỏ tuyến đực của tôm ở độ tuổi postlarva 30-80 (PL30-80) ngày tuổi đã làm thay đổi các đặc điểm sinh dục thứ cấp, chuyển hóa thành con cái, con đực hoặc là bất thường [14]. Mặt khác, những thí nghiệm ban đầu cũng cho thấy việc loại bỏ tuyến đực trên con đực còn non chưa có đặc điểm sinh dục thứ cấp đã mang lại những kết quả đầu tiên về sự biểu hiện tính cái ở con đực (phát triển ống dẫn trứng, hình thành trứng, lỗ mở sinh dục cái), cho khả năng chuyển đổi giới tính cái cao, phát triển tuyến sinh dục cái, có thể giao phối với con đực bình thường và sinh ra thế hệ con toàn đực. Tuy nhiên, số tôm chuyển đổi giới tính đã phát triển thành thục không nhiều và khả năng sinh sản của chúng cũng chưa được kiểm chứng. Nguyễn Văn Hảo (2004) đã ứng dụng thành công kỹ thuật này và tạo được một số
lượng tôm cái giả nhưng tỷ lệ tôm cái giả có khả năng sinh sản còn thấp, tỷ lệ bất thường về tuyến sinh dục và không thể sinh sản còn cao [2].
2.3.2. Cơ sở khoa học của kỹ thuật tạo tôm cái giả bằng phương pháp vi phẫu loại bỏ tuyến đực ở tôm càng xanh
Tôm càng xanh cái trong tự nhiên mang bộ nhiễm sắc thể (NST) giới tính WZ và tôm đực với bộ NST giới tính ZZ . Khi giao phối tạo thế hệ con F1 sẽ có kiểu di truyền NST giới tính theo tỉ lệ 50% ZZ:50% WZ, tương ứng với kiểu hình là 50% tôm đực và 50% tôm cái [2] [14].
Sơ đồ lai của tôm càng xanh bình thường trong tự nhiên:
Tôm cái: WZ x ZZ Tôm đực
Giao tử: W, Z Z
Thế hệ con F1 50% WZ:50% ZZ (50% tôm cái:50% tôm đực) Sau khi tôm càng xanh đực đã chuyển đổi giới tính thành con cái. Con cái này mang bộ NST giới tính của con đực ZZ (con cái giả). Tôm cái giả giao phối với tôm đực bình thường sẽ tạo ra một thế hệ con F1 chỉ có duy nhất một kiểu NST giới tính ZZ , tương ứng với kiểu hình toàn đực theo sơ đồ sau:
Sơ đồ lai giữa tôm cái giả và tôm đực bình thường:
Tôm cái giả ZZ x ZZ Tôm đực
Giao tử: Z Z
2.3.3. Quy trình sản xuất tôm càng xanh toàn đực
.
Hình 2: Sơ đồ quy trình tạo tôm cái giả Ương
PL30-60
Vi phẫu lấy tuyến đực của PL30-60 Kiểm tra chất lượng PL toàn đực (100%) Ấu trùng tôm càng xanh toàn đực Giao vỹ với tôm đực Đẻ và mang trứng Không thành công (loại bỏ) Thành công
(tôm cái giả) Nuôi thành thục Nuôi thương phẩm Nuôi tái phát dục
Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu
Thời gian:17/08-15/10/2007.
Địa điểm: Trung tâm Quốc gia Giống Thủy sản Nước ngọt Nam Bộ, ấp 2, xã An Thái Trung, huyện Cái Bè, tỉnh Tiền Giang.
Đối tượng: Tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1879) cái giả (tôm đã chuyển đổi giới tính bằng phương pháp vi phẫu loại bỏ tuyến đực) tái phát dục.
3.2. Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu 3.2.1. Vật liệu 3.2.1. Vật liệu
Tôm bố mẹ:
-Tôm cái: khoảng 600 con tôm cái giả đã tham gia sinh sản 3 lần với kích cỡ 42,316,47 g/con; 13,92,67 cm.
-Tôm đực: thu mua từ đánh bắt tự nhiên và từ ao nuôi thương phẩm ở gần cơ sở thực tập vo(67,4 39,31 g/con; 12,03 10,28 cm).
Nguồn nước: Sử dụng nguồn nước lấy từ sông Cổ Cò cho vào ba ao lắng-lọc cơ học. Điều kiện nguồn nước: nhiệt độ từ 26-32oC; pH=7,6-8,5; độ trong: 40-52 cm.
Thức ăn:
-Thức ăn tươi:cá biển (cá nục, cá bạc má hoặc cá ngừ), gan bò, ốc (hình 3, 4). -Thức ăn công nghiệp: sản phẩm của công ty Harvest dạng viên, =0,18x3-4 mm với các thành phần dinh dưỡng như sau (hình 5):
Bảng 8: Thành phần dinh dưỡng của thức ăn công nghiệp (theo bao bì)
Thành phần Tỷ lệ (%)
Đạm thô 45%
Chất béo thô 6%
Xơ thô 3%
Hàm lượng tro thô 14%
Độ ẩm 11%
Hình 4: Cá biển.
Chất bổ sung:
-Vitamin C: nguyên chất, dạng bột trắng;
-HUFA: Sản phẩm Turbo-HUFA của Thái Lan (hình 7) đã lưu hành trên thị trường, loại chai nhựa 1L/chai, dạng dung dịch màu vàng cam có các thành phần: DHA (Docosahexaenoic acid)≥22-24%; EPA (Eicosapentaenoic acid)≥20-22%.
Hóa chất: NaHCO3 và NH4Cl dạng bột trắng, nước cất (để test ấu trùng), dung dịch formol nguyên chất để tắm tôm mẹ (hình 6).
3.2.2. Dụng cụ
Dụng cụ cân đo (hình 8):
-Cân điện tử (Max= 410 g, d=0,01 g) để cân trứng tôm, hóa chất, tôm mẹ. -Cân đồng hồ (d=2 g, max=500 g) để cân tôm mẹ và thức ăn.
-Thước kẻ ô ly (d=1 mm, max=30 cm) đo kích thước tôm mẹ. -Cốc nhựa 120 mL để định lượng ấu trùng.
-Kính hiển vi soi nổi MB 0-10, N9704361, của Liên Xô (cũ), độ phóng đại 20. Dụng cụ đo môi trường (hình 9):
-Nhiệt kế đo nhiệt độ thang 100oC với độ chính xác 1oC; -Test kit pH của công ty Thủy Phước;
-Test kit NO2 Sera của Đức; -Test kit NH4+/NH3 Sera của Đức. Thiết bị nuôi và ấp nở (hình 10 và 17):
-Bể ciment (rộng x dài x sâu = 4x6x1 m), hình chữ nhật nuôi tái phát tôm bố mẹ; -Thùng nhựa 160 L để ấp nở tôm mẹ mang trứng cam và xám đậm.
Dụng cụ khác: thùng xốp (xô nhựa 15 L) chuyển tôm mẹ; vợt bắt tôm bố mẹ và ấu trùng; giá thể bằng sợi nylon đen cột thành bó; ống nhựa Bình Minh = 60 mm; thau Hình 6: Hóa chất pha dung dịch testấu trùng. Hình 7: HUFA và Vitamin C.
nhựa 60 L để tắm tôm mẹ, thu ấu trùng chuyển bể ương và tô nhựa 600 mL để test ấu trùng.
3.3. Bố trí thí nghiệm và phương pháp nghiên cứu 3.3.1. Bố trí thí nghiệm (xem sơ đồ hình 3) 3.3.1. Bố trí thí nghiệm (xem sơ đồ hình 3)
Thí nghiệm gồm ba nghiệm thức tương ứng với việc bổ sung sản phẩm Turbo- HUFA ở ba liều lượng khác nhau: 2 mL, 4 mL và 6 mL vào thức ăn công nghiệp và nghiệm thức đối chứng không bổ sung sản phẩm Turbo-HUFA (xem sơ đồ hình 3). Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, cùng lúc (để hạn chế tác động môi trường) và áp dụng chế độ chăm sóc, quản lý như nhau trong suốt quá trình thí nghiệm. Sự bố trí ở mỗi nghiệm thức như sau:
+Tôm bố mẹ nuôi tái phát dục trong bể ciment 24 m3/bể, mực nước 0,7-0,8m, giá thể là bó sợi nylon và ống nhựa được thả 50% diện tích đáy bể, trên 1/3 mặt nước phủ bèo lục bình, có 4-5 vòi sục khí hoạt động 24/24.
+Mật độ nuôi là 2 con/m2, tỷ lệ đực:cái là 1:4. +Chế độ chăm sóc quản lý:
-Điều kiện môi trường luôn theo dõi chặt chẽ, duy trì ổn định, đảm bảo các giá trị dao động trong ngưỡng chịu đựng của tôm nuôi không làm ảnh hưởng đến quá trình tái phát dục và sinh sản của tôm cái: nhiệt độ 28,7-30,4oC; pH=7,84-8,45; TAN:0,006-0,03 mg/L; Nitrite:< 0,3 mg/L.
-Cho ăn: 2 lần /ngày lúc 8h và 17h, khẩu phần thức ăn 3% khối lượng thân tôm. Thức ăn rải đều khắp bể. Dùng thức ăn công nghiệp dạng viên bổ sung sản phẩm Turbo HUFA liều lượng khác nhau ở các nghiệm thức thí nghiệm (2 mL, 4 mL hoặc 6 mL/kg thức ăn) cho ăn vào lúc 8h mỗi ngày. Thức ăn tươi được cắt nhỏ vừa cỡ mồi, cho ăn vào buổi chiều lúc 17h mỗi ngày. Nghiệm thức đối chứng cũng cho ăn như các nghiệm thức thí nghiệm nhưng không bổ sung HUFA vào thức ăn công nghiệp.
-Bể thay nước định kỳ 2 ngày/lần, lượng nước thay mỗi lần là 30-40%. Vệ sinh, thay nước hoàn toàn cho bể 14 ngày/lần và kết hợp kiểm tra tôm nuôi xác định các chỉ tiêu về sinh sản (sức sinh sản, tỷ lệ tái phát dục, số lần đẻ tái phát,...), chất lượng trứng (khối lượng ướt, đường kính trứng, tỷ lệ nở,…), chuyển tôm mang trứng đi ấp nở và đánh giá chất lượng ấu trùng (khả năng chịu đựng trong dung dịch ammonia với các nồng độ 0, 5, 10, 15, 20 ppm).
Sơ đồ thiết kế thí nghiệm (hình 12):
Hình12: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm bổ sung HUFA vào thức ăn với nồng độ khác nhau Đối chứng
THÍ NGHIỆM
Nồng độ HUFA (mL/kg thức ăn)
Đánh giá ảnh hưởng lên:
o Tỷ lệ sống, thời gian lột xác, thời gian tái phát dục, sự phát triển buồng trứng và tỷ lệ tái phát dục, tỷ lệ đẻ;
o Sức sinh sản;
o Khối lượng ướt, đường kính trứng và tỷ lệ nở của trứng; o Chất lượng ấu trùng.
ĐÁNH GIÁ VÀ KẾT LUẬN 6 ml HUFA 4 ml HUFA
2 ml HUFA
3.3.2. Phương pháp theo dõi và xác định các chỉ tiêu
Phương pháp theo dõi thời gian tái phát dục, đẻ trứng, lột xác và sự phát triển của buồng trứng tôm mẹ:
Mỗi bể đặt 3 giỏ nhựa có thả 2 con tôm cái vừa ấp nở hết trứng và chưa tái phát triển tuyến sinh dục. Các chế độ chăm sóc quản lý giống như tôm thả nuôi thí nghiệm trong bể. Định kỳ 3 ngày/lần kéo giỏ nhựa lên quan sát theo dõi sự phát triển của tuyến sinh dục ở giáp đầu ngực của tôm cái theo phương
pháp của Nguyễn Thanh Phương (2003) [8]. Khi thấy bắt đầu có tuyến sinh dục thì ghi ngày để tính thời gian tái phát dục. Sau đó, tiếp tục theo dõi đo kích thước buồng trứng và tính thời gian phát triển tương ứng với từng giai đoạn. Chiều dài buồng được đo từ điểm cuối khoang giáp đầu ngực ngược trở lên hướng chủy (thước đặt song song và đọc theo chiều mũi tên AB hình 13). Khi
tôm lột xác thì ghi thời gian để tính thời gian lột xác và khi tôm mẹ đẻ trứng thì cũng ghi thời gian đẻ trứng.
Phương pháp xác định tỷ lệ tái phát dục, tỷ lệ đẻ:
Định kỳ 14 ngày/lần rút cạn nước trong bể vệ sinh chà bể và kiểm tra số lượng tôm mang trứng và tôm tái phát dục. Tôm tái phát dục được tính bằng tổng số tôm cái mang trứng, vừa chớm hoặc đang có tuyến sinh dục ở giáp đầu ngực.
Tỷ lệ tái phát dục (%) = (số tôm tái phát dục/số tôm thí nghiệm) x100. Tỷ lệ đẻ (%)=(số tôm mang trứng/ số tôm thí nghiệm)x100.
Phương pháp đánh dấu mắt tôm:
Tôm cái đẻ ở lần đầu trong thí nghiệm sẽ cột dây nylon màu ở cuống mắt để đánh dấu lần đẻ này và màu dây ứng với các nghiệm thức là: 2 mL-dây xanh, 4 mL-dây đỏ, 6 mL-dây đen, đối chứng-dây vàng. Sau đó, ở những lần sinh sản tiếp theo, nếu tôm đã cột dây tiếp tục đẻ thì sẽ tiếp tục đánh dấu bằng sợi nylon cùng màu với lần trước. Dựa vào số dây để tính số lần đẻ/con tôm cái.
Phương pháp xác định sức sinh sản tôm mẹ:
Chọn 3 con tôm cái mang trứng màu vàng cam (hình 14) cùng màu, bụng đầy trứng ở mỗi lô đem cân khối lượng cơ thể (m1) rồi đưa vào bể ấp riêng theo từng nghiệm thức.
Đồng thời lấy 0,03 g trứng (lấy 3 mẫu ở 3 vị trí khác nhau của buồng trứng, mỗi mẫu 0,01 g) sử dụng cân có độ chính xác 0,01 g để lấy mẫu cho vào đĩa petri, dùng pipet
A B
Hình 13: Cách đo chiều dài buồng trứng tôm cái.
đư
ờng kính
B
A
Hình 15: Phương pháp đo đường kính trứng.
nhỏ vài giọt nước vào mẫu trứng đếm số trứng, lấy kết quả trung bình (N1 trứng). Sử dụng 3 cá thể cho mỗi nghiệm thức.
Sau khi trứng nở hết, đem 3 tôm mẹ trên cân lại để biết khối lượng tôm mẹ (m2) và đếm số ấu trùng (M) tương ứng. Các chỉ tiêu sức sinh sản cụ thể như sau:
♠ Sức sinh sản tuyệt đối tính bằng tổng số trứng trên một con tôm cái một lần đẻ.
♠ Sức sinh sản tương đối tính bằng số trứng trên một gam khối lượng cơ thể tôm mẹ.
♠ Sức sinh sản thực tế tính bằng số ấu trùng trên một gam khối lượng cơ thể tôm mẹ. Phương pháp đo đường kính trứng:
Lấy ngẫu nhiên 10 trứng trên 1 buồng trứng rồi đo đường kính từng trứng bằng kính hiển vi soi nổi ở độ phóng đại 20, lặp lại 3 lần và tính kết quả trung bình (hình 15).
Phương pháp xác định khối lượng ướt của trứng:
-Chọn tôm cái mang trứng đầy, trứng màu vàng cam (mới đẻ), chọn 3 con/nghiệm thức.
-Dùng kim mũi giáo tách và kéo cắt lấy 3 mẫu trứng/buồng trứng ở các vị trí khác nhau và lấy 0,01 g/mẫu trứng (dùng cân điện tử cân mẫu trứng).
-Đặt các mẫu trứng trên đĩa petri, nhỏ lên một ít nước sạch cho trứng rời nhau dùng kim tách nhẹ trứng và đếm tổng số lượng trứng ở mỗi mẫu.
-Lặp lại ba lần cách lấy mẫu và đếm trứng như trên, lấy kết quả để tính giá trị trung bình khối lượng ướt của mỗi trứng ở từng nghiệm thức.
Hình 14: Tôm cái mang trứng vàng cam (mới đẻ).
Phương pháp ấp nở và định lượng ấu trùng:
Tôm mẹ mang trứng được chuyển vào bể ấp nở riêng biệt ứng với các nghiệm thức khác nhau và được thuần hoá độ mặn dần đến 12‰. Hàng ngày kiểm tra thấy trứng tôm chuyển sang màu xám đậm (hình 16) đưa tôm ra thau nhựa 60 L tắm formalin 20-25 ppm sau 30 phút chuyển vào thùng nhựa 160 L sục khí liên tục, độ mặn 12‰,pH=7.5-8.0, nhiệt độ: 29-30oC (hình 17).
Sau 2 ngày trứng đã nở hết thành ấu trùng thì dùng vợt thu hết ấu trùng cho vào 1 lít nước lợ sạch, trộn nhẹ cho ấu trùng phân tán đều, dùng cốc thuỷ tinh 120 mL lấy mẫu 3 lần ở những vị trí khác nhau rồi đếm số ấu trùng trong mỗi mẫu, lấy kết quả trung bình và tính số ấu trùng tổng số đã thu được.
Phương pháp kiểm tra chất lượng ấu trùng [28] (trao đổi riêng):
Ấu trùng một ngày tuổi được đánh giá chất lượng bằng cách xác định nồng độ ammonia gây chết 50% số ấu trùng thí nghiệm sau 24 giờ thử (24h-LC50) (phương pháp Trimmed Spearman Karber).
Cách pha dung dịch sốc ấu trùng:
-Lấy 300 mg NaHCO3 hoà tan vào 1 L nước cất được dung dịch A.
-Lấy 2,93 g NH4Cl hoà tan vào 1 L dung dịch A được dung dịch NH4+-N 1000 ppm (dung dịch B) (coi như bằng nồng độ ammonia tổng số, kí hiệu: TAN).
Khi cần sốc ấu trùng kiểm tra chất lượng trong dung dịch ammonia nồng độ x ppm thì chỉ cần lấy x mL dung dịch B pha vào 1 L nước lợ sạch độ mặn 12‰ là được dung dịch thử có nồng độ như mong muốn.Với ấu trùng 1 ngày tuổi nồng độ TAN test là 0, 5, 10, 15, 20 ppm.
Hình 16: Tôm cái mang trứng
Cách bố trí thí nghiệm:
Các tô nhựa dung tích 600 mL được đổ 500 mL dung dịch test theo các nồng độ thử với ba lần lặp lại. Sau đó khoảng 30 phút thì bố trí vào mỗi tô 30 ấu trùng và dùng máy đo pH để ghi lại pH ban đầu. Các tô để nơi thoáng mát, nhiệt độ 29-30oC.
Sau 24 giờ kể từ khi bố trí thí nghiệm ấu trùng vào tô thì tiến hành lấy kết quả thí nghiệm bằng cách đo pH và đếm số ấu trùng chết. Ấu trùng chết là ấu trùng không còn phản ứng trước những kích thích cơ học và các phụ bộ [28]. Nếu tỷ lệ chết của ấu trùng ở