Chuẩn bị dung dịch đệm pH = 5,0 và pH = 7,4
Thêm 27,8 g NaH2PO4 vào 1000 mL nước khử ion và 71,1 g Na2HPO4.12H2O vào 1000 mL nước khử ion.
Pha dung dịch có pH = 5,0: Cho 1 mL dung dịch Na2HPO4 vào 150 mL dung dịch NaH2PO4, thu được dung dịch có pH = 5,0 (điều chỉnh bằng máy điều chỉnh pH).
Pha dung dịch có pH = 7,4: Cho 81 mL dung dịch Na2HPO4 vào 19 mL dung dịch NaH2PO4 thu được dung dịch có pH = 7,4.
Dung dịch phân tích và dung dịch chuẩn được chuẩn bị tương tự như trường hợp định tính ketoprofen bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.
Chuẩn bị dung dịch đo mẫu
- Ngâm mẫu trong dung dịch có pH = 5,0.
Lấy 100 mg mẫu nano β-cyclodextrin–alginate–ketoprofen chứa hàm lượng ketoprofen là 10% cho vào 10 mL dung dịch có pH = 5,0, khuấy từ tốc độ 50 vòng/phút, nhiệt độ 37°C±1°C. Ngâm mẫu này khoảng 30 phút, gạn và thu lấy dung dịch 1. Sau đó, thêm tiếp 10 mL dung dịch pH = 5,0 vào rồi tiếp tục ngâm mẫu thêm 30 phút trước khi gạn và thu lấy dung dịch 2.
Tiếp tục cho 10 mL dung dịch pH = 5,0 vào mẫu và ngâm với thời gian 60 phút rồi gạn lấy dung dịch 3. Lặp lại quá trình trên nhưng với thời gian 60 phút mới thực hiện một lần.
Thu các dung dịch ở từng thời điểm khác nhau (dung dịch 1, dung dịch 2, …) rồi mỗi dung dịch này được chiết với 10 mL diethyl ether. Sau đó lớp hữu cơ được cô đuổi dung môi và thu một chất rắn. Cho chất rắn này vào 1 mL methanol. Dịch methanol được lọc qua màng milipore trước khi bơm vào máy HPLC.
- Ngâm mẫu trong dung dịch có pH = 7,4.
Chuẩn bị mẫu tương tự như trường hợp pH = 5,0. Kết quả đo độ phóng thích
Bảng 13 Kết quả đo độ phóng thích ketoprofen theo thời gian
Thời gian (giờ) 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0
Nồng độ ketoprofen (mg/mL) theo thời gian
pH = 5,0 pH = 7,4 1,9 0,5 3,8 1,6 5,5 2,7 6,6 5,1 6,9 5,7 Hình 33 Khả năng phóng thích thuốc ở pH = 5,0 và pH = 7,4
Kết quả phân tích khả năng phóng thích thuốc của các mẫu cho thấy lượng ketoprofen đã phóng thích ra ở pH = 5,0 sau 4 giờ là 69%; trái lại, trong cùng thời gian ở pH = 7,4 lượng ketoprofen phóng thích đạt 57%. Điều này chứng tỏ lượng ketoprofen phóng thích ở pH = 5,0 nhiều hơn ở pH = 7,4.
Chương 4
THỰC NGHIỆM
------
4.1 QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM
Pha chế hóa chất để phục vụ thí nghiệm.
Tổng hợp phức β-cyclodextrin/ketoprofen bằng phương pháp khuấy từ (khảo sát tỷ lệ ketoprofen:β-cyclodextrin, thời gian và nhiệt độ phản ứng) và phương pháp vi sóng (khảo sát công suất và thời gian phản ứng).
Tổng hợp nano β-cyclodextrin–alginate (khảo sát tỷ lệ β-cyclodextrin:alginate) và nano β-cyclodextrin–alginate–ketoprofen (khảo sát tỷ lệ β-cyclodextrin:alginate và hàm lượng ketoprofen).
Pha chế hóa chất để phục vụ thí nghiệm
Pha chế dung dịch CaCl2 (10,05 mg/mL)
Lấy 5025 mg = 5,025 g CaCl2 hòa tan vào 500 mL nước khử ion thu được 500 mL dung dịch CaCl2 (10,05 mg/mL).
Pha chế dung dịch sodium alginate (9,0 mg/mL)
Lấy 4500 mg = 4,5 g sodium alginate hòa tan vào 500 mL nước khử ion thu được 500 mL dung dịch sodium alginate (9,0 mg/mL).
Pha chế dung dịch β-cyclodextrin (2,4 mg/mL)
Lấy 1200 mg = 1,2 g β-cyclodextrin hòa tan vào 500 mL nước khử ion thu được 500 mL dung dịch β-cyclodextrin (2,4 mg/mL).
Pha chế dung dịch alcohol:nước (tỷ lệ alcohol:nước = 1:1)
Lấy 100 mL ethanol (C2H5OH) hòa tan vào 100 mL nước khử ion thu được 200 mL dung dịch alcohol:nước = 1:1.
Lấy 663 mg = 0,663 g ketoprofen hòa tan vào 200 mL dung dịch alcohol:nước đã được pha chế ở trên, ta được 200 mL dung dịch ketoprofen (3,315 mg/mL).
4.2 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
Các nghiệm thức được bố trí một cách ngẫu nhiên.
4.2.1 Tổng hợp phức β-cyclodextrin/ketoprofen
4.2.1.1 Phương pháp khuấy từ
Thí nghiệm 1Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ ketoprofen:β-cyclodextrin đến
hiệu suất tổng hợp phức β-cyclodextrin/ketoprofen
Thí nghiệm được thực hiện trên 4 nghiệm thức (tương ứng với các tỷ lệ ketoprofen:β-cyclodextrin là 1:1, 1:5, 1:8 và 1:10), mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, chọn ngẫu nhiên một mẫu trong nghiệm thức cho hiệu suất tổng hợp phức là cao nhất để đo IR.
Thí nghiệm 2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu suất
tổng hợp phức β-cyclodextrin/ketoprofen
Dựa vào kết quả khảo sát tỷ lệ ketoprofen:β-cyclodextrin (Thí nghiệm 1), chọn tỷ lệ tối ưu để khảo sát trên 4 nghiệm thức (tương ứng với các thời gian 30 phút, 60 phút, 90 phút và 120 phút), mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, chọn ngẫu nhiên một mẫu trong nghiệm thức cho hiệu suất tổng hợp phức là cao nhất để đo IR.
Thí nghiệm 3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hiệu suất
tổng hợp phức β-cyclodextrin/ketoprofen
Từ kết quả khảo sát thời gian phản ứng (Thí nghiệm 2), chọn thời gian tối ưu để khảo sát trên 4 nghiệm thức (tương ứng với các nhiệt độ 80°C, 100°C, 120°C và 140°C), mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, chọn ngẫu nhiên một mẫu trong nghiệm thức cho hiệu suất tổng hợp phức cao nhất để đo IR.
4.2.1.2 Phương pháp vi sóng
Thí nghiệm 4 Khảo sát ảnh hưởng của công suất đến hiệu suất tổng hợp
Dựa vào kết quả khảo sát tỷ lệ ketoprofen:β-cyclodextrin (Thí nghiệm 1), chọn tỷ lệ tối ưu để khảo sát trên 4 nghiệm thức (tương ứng với các công suất 200 W, 300 W, 450 W và 600 W), mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, chọn ngẫu nhiên một mẫu trong nghiệm thức cho hiệu suất tổng hợp phức cao nhất để đo IR.
Thí nghiệm 5 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu suất
tổng hợp phức β-cyclodextrin/ketoprofen
Sau khi khảo sát công suất (Thí nghiệm 4), chọn công suất tối ưu để khảo sát trên 3 nghiệm thức (tương ứng với thời gian phản ứng 5 phút, 10 phút và 15 phút), mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, chọn ngẫu nhiên một mẫu trong nghiệm thức cho hiệu suất tổng hợp phức cao nhất để đo IR.
4.2.2 Tổng hợp các nano
4.2.2.1 Nano β-cyclodextrin–alginate
Thí nghiệm 6 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ β-cyclodextrin:alginate đến
hiệu suất tổng hợp nano β-cyclodextrin–alginate
Thí nghiệm được thực hiện dựa trên 4 nghiệm thức (tương ứng với các tỷ lệ β-cyclodextrin:alginate là 1:1, 1:5, 1:10 và 1:15), mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, chọn ngẫu nhiên một mẫu trong nghiệm thức cho hiệu suất tổng hợp nano cao nhất để đo IR và chụp ảnh SEM.
4.2.2.2 Nano β-cyclodextrin–alginate–ketoprofen
Thí nghiệm 7 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ β-cyclodextrin:alginate đến
hiệu suất tổng hợp nano β-cyclodextrin–alginate–ketoprofen
Thí nghiệm được thực hiện dựa trên 4 nghiệm thức (tương ứng với tỷ lệ β-cyclodextrin:alginate lần lượt là 1:1, 1:5, 1:10 và 1:15), mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, chọn ngẫu nhiên một mẫu trong nghiệm thức cho hiệu suất tổng hợp nano cao nhất để đo IR, chụp ảnh SEM và TEM.
Thí nghiệm 8Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng ketoprofen đến hiệu suất
Dựa vào kết quả khảo sát tỷ lệ β-cyclodextrin:alginate (Thí nghiệm 7), chọn tỷ lệ tối ưu để khảo sát trên 4 nghiệm thức (tương ứng với các hàm lượng ketoprofen 5%, 10%, 12% và 15%), mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, chọn ngẫu nhiên một mẫu trong nghiệm thức cho hiệu suất tổng hợp nano β-cyclodextrin–alginate–ketoprofen là cao nhất để đo IR và chụp ảnh SEM.
Xử lý số liệu
Các nghiệm thức được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên và được đánh giá bằng phần mềm Statgraphics plus, tự động đánh giá độ khác nhau giữa các nghiệm thức với trắc nghiệm bình phương la tinh LSD độ tin cậy là 95,0%.
4.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP
4.3.1 Tổng hợp phức β-cyclodextrin/ketoprofen bằng phương pháp khuấy từ khuấy từ
Việc hình thành phức β-cyclodextrin/ketoprofen xảy ra trong pha nước không có sử dụng những chất độc hại.
Quy trình tổng hợp phức β-cyclodextrin/ketoprofen
Sơ đồ 1 Quy trình tổng hợp phức β-cyclodextrin/ketoprofen bằng
phương pháp khuấy từ
Các bước tiến hành tổng hợp
β-Cyclodextrin được hòa tan trong nước khử ion ở 100°C. Ketoprofen được thêm vào, hỗn hợp này được khuấy trong thời gian 60 phút ở 100°C (Hình 34).
Tiếp theo, hỗn hợp này được làm lạnh và khuấy ở 0°C để tạo kết tủa trắng
(Hình 35). Phức β-cyclodextrin/ketoprofen Ketoprofen, khảo sát tỷ lệ ketoprofen:β-cyclodextrin β-Cyclodextrin, khảo sát tỷ lệ ketoprofen:β-cyclodextrin Nước khử ion (100°C)
Khuấy từ, khảo sát thời gian phản ứng, khảo sát nhiệt độ phản ứng
Làm lạnh ở 0°C Ly tâm, rửa lại 3 lần
với nước khử ion Sấy thường 60°C, 16 giờ
Hình 34 Hỗn hợp β-cyclodextrin và ketoprofen
Hình 35 Phức β-cyclodextrin/ketoprofen kết tủa
Sau đó, ly tâm (tốc độ 4000 vòng/phút, trong 10 phút, rồi rửa lại với nước khử ion 3 lần, mỗi lần ly tâm trong 10 phút). Đem mẫu này sấy khô thường ở 60°C trong 16 giờ. Kết quả thu được sản phẩm là chất rắn màu trắng.
- Thời gian và nhiệt độ được giữ không đổi, thay đổi tỷ lệ giữa ketoprofen và β-cyclodextrin để khảo sát sự ảnh hưởng của nó đến hiệu suất tổng hợp phức. Tỷ lệ ketoprofen:β-cyclodextrin được khảo sát là 1:1, 1:5, 1:8 và 1:10.
- Dựa vào kết quả khảo sát tỷ lệ ketoprofen:β-cyclodextrin, chọn tỷ lệ tối ưu để khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian đối với hiệu suất tạo phức. Thời gian phản ứng được khảo sát là 30 phút, 60 phút, 90 phút và 120 phút. Nhiệt độ được giữ không đổi.
- Từ kết quả khảo sát thời gian phản ứng, chọn thời gian tối ưu để khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hiệu suất tạo phức. Phản ứng được tiến hành ở các nhiệt độ khác nhau 80°C, 100°C, 120°C và 140°C. Tỷ lệ ketoprofen:β-cyclodextrin được giữ cố định.