NANO TỪ ALGINATE
Quy trình điều chế hạt nano chứa alginate6
7,5 mL dung dịch calcium chloride được nhỏ vào cốc chứa 117,5 mL dung dịch alginate trong thời gian 60 phút. Lượng insulin tương đương được trộn vào dung dịch alginate trước khi thêm calcium chloride để gel hóa alginate. Sau đó, 25 mL dung dịch chitosan được thêm vào gel khoảng 120 phút. pH của dung dịch alginate và chitosan là 4,9 và 4,6 để tạo sự phân tán keo với pH cuối là 4,7. Khuấy thêm 30 phút, sau đó ly tâm ở 4°C thu hạt nano.
Quy trình điều chế hạt nano alginate–chitosan chứa nifedipine45
Nhỏ 300 µL dung dịch nifedipine (nifedipine hòa tan trong hỗn hợp alcohol/nước, 1:1) vào dung dịch calcium chloride. Tiếp theo nhỏ hỗn hợp này vào 10 mL sodium alginate và khuấy. Sau đó cho 4 mL dung dịch chitosan vào và khuấy. Huyền phù tổng hợp được để qua đêm để hình thành các hạt nano.
Quy trình điều chế nano hình cầu sodium alginate61
10,2 mL calcium chloride được thêm vào 38 mL dung dịch sodium alginate để tạo gel. Sau đó, 16 mL poly-L-lysine được thêm vào để hình thành phức. Huyền phù nano hình cầu tạo thành được khuấy khoảng 2 giờ và giữ qua đêm để ổn định. Nano hình cầu được phân tách bằng cách ly tâm và đem sấy khô chân không.
Quy trình điều chế nanohydrogel alginate58
20 mL dung dịch sodium alginate được bão hòa bằng lượng tương đương chloroform hòa tan trong cholin. Nhũ tương nước/dầu được điều chế bằng cách khuấy.
Để phân tán nước vào pha dầu, 100 mL chloroform được thêm vào nhũ tương nước/dầu và khuấy. Kết quả dẫn đến sự đông đặc của nanohydrogel alginate, nhũ tương nước/dầu được để ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. 100 mL CaCl2 được thêm vào để làm cho đông khô nanohydrogel sodium alginate. Sau đó ly tâm. Nanohydrogel alginate phân lập và rửa bằng nước cất, chloroform được loại bỏ bằng cách thêm lượng nước và ly tâm. Đem nanohydrogel alginate thu được đông khô thu sản phẩm.
β-Cyclodextrin đã được sử dụng như là tá dược trong dược phẩm. Đã có nhiều công trình nghiên cứu tạo phức giữa β-cyclodextrin và các loại thuốc. Tuy nhiên, bằng cách này không tạo được sản phẩm có kích thước nano do tương tác quá chặt chẽ của liên kết hydro nên chỉ tạo ra được clathrate.
Cho đến nay còn rất ít công trình nghiên cứu tạo nano từ β-cyclodextrin. Muốn tạo kích thước nano cần tiến hành phản ứng với diphenyl carbonate để hạn chế sự tương tác của các nhóm OH hay dùng polymer làm chất bao. Sodium alginate là phụ gia thực phẩm đã được chúng tôi nghiên cứu ứng dụng làm màng bao để chế tạo tổ hợp β-cyclodextrin–alginate–ketoprofen có kích thước nano và được trình bày trong nội dung nghiên cứu của luận văn này.
Chương 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
------
2.1 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ 2.1.1 Thiết bị
- Máy khuấy từ gia nhiệt (Heating Magnetic Stirrer – VELP Scientifica). - Cân điện tử Mettler Toledo Ab204, Sartorius GP 1503 P.
- Kích thước và hình dạng hạt nano được đo bởi SEM và TEM.
Máy đo SEM (JEOL – JSM-7401F, Field Emission Scanning Electron Microscope), nơi thực hiện Viện Công nghệ Hóa học.
Máy đo TEM (JEM-1400, kính hiển vi Hitachi H8100 có thế gia tốc 200kV, nguồn phát electron LaB6, độ phân giải 0,14 nm), nơi đo Trường Đại học Bách Khoa.
- Phổ hồng ngoại (IR) được đo trên máy IR-Equinox 55 – Bruker (Đức), nơi thực hiện Viện Công nghệ Hóa học.
- Máy đông khô (Micromodulyo Freeze Dryer – Thermo Electron Corporation), nơi thực hiện Viện Công nghệ Sinh học.
- Máy đo DSC (NETSZCH – DSC 204 – Đức), nơi thực hiện Trường Đại học Bách Khoa.
- Định tính và định lượng ketoprofen trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Agilent 1100 series, nơi thực hiện Viện Công nghệ Hóa học.
- Nước khử ion được cất trên máy Easy Pure II - UV Ultrapure Water System. - Tủ sấy thường, cân thường và cân vi lượng.
- Lò vi sóng (EMM 2015 – Electrolux, 1000 W Grill). - Máy điều chỉnh pH Hannan Instrument.
2.1.2 Dụng cụ
- Bình tam giác loại 50 mL, 100 mL, 250 mL. - Bescher loại 50 mL, 100 mL, 250 mL.
- Ống hút, pipet, đũa thủy tinh, cá từ, lọ thủy tinh, chai đựng mẫu, ống đong 50 mL, 25 mL, 10 mL, 5 mL.
- Bình định mức 100 mL, 500 mL.
2.2 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT2.2.1 Nguyên liệu và hóa chất 2.2.1 Nguyên liệu và hóa chất
Bảng 2 Danh mục nguyên liệu và hóa chất đã sử dụng
Nguyên liệu Hóa chất
- Ketoprofen do Merk cung cấp diethyl ether, ethanol, methanol, acetonitril, amonium acetate - Nước cất, nước khử ion
2.2.2 Giới thiệu sơ lược về đặc điểm và tính chất của một số nguyên liệu liệu
2.2.2.1 Alginate1,9
Alginate là thuật ngữ được dùng cho muối của alginic acid, những chất bắt nguồn từ alginic acid.
Alginate có trong vách tế bào tảo nâu (Phacophycae) dưới dạng muối calcium, magnesium hoặc sodium của acid alginic. Loại muối calcium và magnesium của alginic thì không tan trong nước. Do đó, phải tách chiết alginate dạng bột khô có thể tan trong nước và loại bỏ những thành phần khác của tảo biển qua quá trình kết tủa.
Alginate là một polysaccharide không có độc tính, dễ phân hủy sinh học. Alginate là copolymer tuyến tính gồm những dãy luân phiên nhau bởi liên kết 1,4 của α-L-guluronic acid và β-D-mannuronic acid.
Alginate được ứng dụng trong phân hủy sinh học, tương hợp sinh học, trong dược phẩm có hoạt tính cao và trong hóa sinh như dẫn truyền thuốc đến các cơ quan mong muốn trong cơ thể và đóng chặt tế bào, được ứng dụng để làm màng nhày.
Tính chất
Alginate có khả năng tan trong nước tạo thành dạng sền sệt.
Alginate có tính chất keo nên có thể sử dụng để sản xuất những hạt gel bằng cách tập hợp những hạt keo rất nhỏ lại với nhau rồi đem đông đặc trước, sau đó thêm dung dịch polycationic để làm ra chất có trọng lượng phân tử cao, phức tạp làm lớp vỏ phủ bên ngoài cho thuốc.
O OH C O OH O O OH C O O-Na+ OHO O OH C O +Na-O O OH OOH C O O-Na+ O OH +Na-O O
Hình 7 Sodium alginate (C6H7NaO6)n
2.2.2.2 Ketoprofen1,88,93
Ketoprofen (C16H14O3) là thuốc kháng viêm không steroid thuộc nhóm propionic acid phổ biến (NSAID).
Tên khoa học: 2-[3-(Benzoyl)phenyl]propionic acid. Phân tử lượng của ketoprofen: 254,281.
O
O CH3
OH
Hình 8 Cấu tạo của ketoprofen
Ketoprofen có màu trắng hoặc trắng nhạt, không mùi, không hút ẩm, dạng bột mịn, nhiệt độ nóng chảy khoảng 95ºC. Không tan trong nước ở 20oC, nhưng tan hoàn toàn trong kiềm mạnh, ethanol 96%, chloroform, acetone, ether. Cực đại hấp thụ trong methanol ở bước sóng 254 nm.
Định tính bằng các phương pháp đo quang phổ hồng ngoại; sắc ký lớp mỏng; đo phổ tử ngoại; đo điểm chảy hay đo nhiệt quét vi sai (DSC); sắc ký lỏng hiệu năng cao hay điện di mao quản.
Định lượng bằng các phương pháp chuẩn độ acid – base; đo quang phổ tử ngoại hay sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Tác dụng dược lý
Ketoprofen sử dụng để điều trị giảm đau nhẹ và giúp làm giảm triệu chứng viêm khớp, viêm khớp xương mãn tính và bệnh thấp khớp. Bên cạnh đó, ketoprofen có tác dụng kháng viêm, giảm đau, hạ sốt. Tác dụng chống viêm, giảm đau mạnh.
Phản ứng phụ có hại
Ketoprofen được chỉ định sử dụng rất nhiều nhưng việc sử dụng chúng thường kèm theo các phản ứng phụ có hại, nhất là khi sử dụng bằng đường uống. Tác dụng phụ điển hình là gây các rối loạn dạ dày ruột trên như buồn nôn, khó tiêu và rối loạn vùng thượng vị. Một số phản ứng ít xảy ra trên hệ thần kinh như nhức đầu, buồn ngủ, chóng mặt và trên hệ dạ dày ruột dưới như tiêu chảy, táo bón, đầy hơi.
2.3 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ CÁC THIẾT BỊ SỬ DỤNG2.3.1 Kính hiển vi điện tử quét91 2.3.1 Kính hiển vi điện tử quét91
Kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope, SEM) là một loại kính hiển vi điện tử có thể tạo ra ảnh với độ phân giải cao của bề mặt mẫu vật bằng cách sử dụng một chùm điện tử hẹp (chùm các electron) quét trên bề mặt mẫu. Việc tạo ảnh của mẫu vật được thực hiện thông qua việc ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ tương tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu vật.
Hình 9 Máy đo SEM
Ưu điểm: Mặc dù không thể có độ phân giải tốt như kính hiển vi điện tử truyền qua nhưng kính hiển vi điện tử quét lại có điểm mạnh là phân tích mà không cần phá hủy mẫu vật và có thể hoạt động ở chân không thấp. Một điểm mạnh khác của SEM là các thao tác điều khiển đơn giản hơn rất nhiều so với TEM khiến cho nó rất dễ sử dụng. Một điều khác là giá thành của SEM thấp hơn rất nhiều so với TEM, vì thế SEM phổ biến hơn rất nhiều so với TEM.
2.3.2 Kính hiển vi điện tử truyền qua1
Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscope, TEM) là một thiết bị nghiên cứu vi cấu trúc vật rắn, sử dụng chùm điện tử có năng lượng cao chiếu xuyên qua mẫu vật rắn mỏng và sử dụng các thấu kính từ để tạo ảnh với độ phóng đại lớn (có thể tới hàng triệu lần), ảnh có thể tạo ra trên màn huỳnh quang, hay trên film quang học, hay ghi nhận bằng các máy chụp kỹ thuật số.
Ưu điểm: Tạo ra ảnh cấu trúc vật rắn với độ tương phản, độ phân giải rất cao đồng thời dễ dàng thông dịch các thông tin về cấu trúc. TEM cho ảnh thật của cấu trúc bên trong vật rắn nên đem lại nhiều thông tin hơn, đồng thời rất dễ dàng tạo ra các hình ảnh này ở độ phân giải tới cấp độ nguyên tử. Nhiều phép phân tích rất hữu ích đem lại nhiều thông tin cho nghiên cứu vật liệu.
Nhược điểm: Giá thành của nó rất cao, đồng thời đòi hỏi các điều kiện làm việc cao chẳng hạn chân không siêu cao, sự ổn định về điện và nhiều phụ kiện đi kèm.
2.3.3 Máy đông khô
Máy đông khô được xây dựng trên nguyên lý ướp lạnh và làm khô chân không. Máy hoạt động không cần có cả hệ thống nào, chỉ cần nguồn điện ba pha là nó có thể làm việc được, nó làm việc một cách độc lập.
Cấu tạo: Máy đông khô có cấu tạo gọn gàng, buồng khí lạnh và hộp sấy của máy là một khối tổng thể, luồng không khí lạnh giảm nhiệt nhanh và với số lượng lớn. Sự phát tán nguồn nhiệt đồng đều và dễ dàng điều khiển nhiệt độ. Buồng sấy chính được lắp vào khung bảo vệ nhiệt và có thể làm việc tại nhiệt độ ở -40°C.
2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1 Tổng hợp phức β-cyclodextrin/ketoprofen
2.4.1.1 Tổng hợp phức β-cyclodextrin/ketoprofen bằng phương pháp khuấy từ
Phức giữa β-cyclodextrin và ketoprofen được tổng hợp dựa theo sơ đồ trình bày ở trang 73.
Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giữa ketoprofen và β-cyclodextrin đối với hiệu suất tạo phức β-cyclodextrin/ketoprofen. Sau đó, chọn ra tỷ lệ tốt nhất để khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian đối với hiệu suất tạo phức.
Sau khi khảo sát thời gian phản ứng, chọn ra thời gian tối ưu để khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ lên hiệu suất của quá trình tổng hợp phức.
2.4.1.2 Tổng hợp phức β-cyclodextrin/ketoprofen bằng phương pháp vi sóng
Tổng hợp phức β-cyclodextrin và ketoprofen dựa theo sơ đồ tổng hợp được trình bày ở trang 75.
Khảo sát sự ảnh hưởng của công suất lên hiệu suất tạo phức.
Sau khi khảo sát công suất, chọn ra công suất tối ưu để khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian phản ứng đối với hiệu suất tạo phức.
2.4.2 Tổng hợp các nano
2.4.2.1 Tổng hợp nano β-cyclodextrin–alginate
Nano β-cyclodextrin–alginate được tổng hợp theo sơ đồ tổng hợp được trình bày ở trang 78.
Khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ giữa β-cyclodextrin và alginate đối với hiệu suất tổng hợp nano β-cyclodextrin–alginate.
2.4.2.2 Tổng hợp nano β-cyclodextrin–alginate–ketoprofen
Nano β-cyclodextrin–alginate–ketoprofen được tổng hợp theo sơ đồ được trình bày ở trang 80.
Khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ giữa β-cyclodextrin và alginate đến hiệu suất tổng hợp nano β-cyclodextrin–alginate–ketoprofen. Sau khi khảo sát tỷ lệ, chọn tỷ lệ tốt nhất để khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ketoprofen đến hiệu suất tổng hợp nano.
2.4.3 Các phương pháp phân tích sản phẩm
Đặc điểm hình dạng, kích thước của phức và các hạt nano đã tổng hợp được xác định bằng cách đo SEM (kính hiển vi điện tử quét), TEM (kính hiển vi điện tử truyền qua). Các mẫu đo SEM và TEM là mẫu sau khi tổng hợp đến giai đoạn tách ly tâm (sau khi rửa lại 3 lần với nước khử ion để loại các hóa chất còn dư).
Sản phẩm phức β-cyclodextrin/ketoprofen, nano β-cyclodextrin–alginate và nano β-cyclodextrin–alginate–ketoprofen được xác định bằng phổ IR. Sản phẩm đem đi phân tích phổ IR là mẫu sau khi đã được tổng hợp đến giai đoạn cuối cùng và là chất rắn màu trắng đối với phức (sau khi đã sấy khô), chất xốp màu trắng đối với nano (sau khi đã đông khô). Chứng minh trong phức β-cyclodextrin/ketoprofen và nano β-cyclodextrin–alginate–ketoprofen có mặt của ketoprofen dựa vào việc phân tích phổ hồng ngoại IR.
Bên cạnh đó sắc ký bản mỏng còn được dùng làm phương pháp định tính ketoprofen: Chấm trên cùng một bản mỏng dung dịch của ketoprofen chuẩn và dung dịch của mẫu phức sau khi đã được sấy khô, dung dịch ketoprofen chuẩn và mẫu nano sau khi đã đem đông khô (các dung dịch này về phương pháp chuẩn bị được trình bày cụ thể ở trang 59, 60). Sau giải ly bản mỏng được soi dưới đèn UV cho thấy các vết màu tương ứng với từng dung dịch. Sau khi so sánh các vết màu với nhau có thể biết được trong phức β-cyclodextrin/ketoprofen và nano β-cyclodextrin–alginate– ketoprofen có chứa ketoprofen hay không.
Ngoài ra, còn sử dụng phương pháp phân tích nhiệt quét vi sai DSC để xác định sự hiện diện của ketoprofen trong phức β-cyclodextrin/ketoprofen và nano β-cyclodextrin–alginate–ketoprofen, đồng thời ghi nhận sự chuyển pha từ cấu trúc tinh thể sang vô định hình (phương pháp chuẩn bị được trình bày cụ thể ở trang 60, 61).
Để xác định hàm lượng ketoprofen có trong các mẫu nano β-cyclodextrin– alginate–ketoprofen đã tổng hợp được chúng tôi tiến hành phân tích mẫu trên thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (phương pháp phân tích được trình bày ở trang 62). Dung dịch ketoprofen chuẩn và các dịch chiết từ mẫu nano được phân tích trên máy HPLC. Để biết được hàm lượng ketoprofen trong các mẫu đem phân tích so sánh diện tích các peak của dịch chiết từ các mẫu nano với diện tích peak của ketoprofen chuẩn.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
------
3.1 PHỨC β-CYCLODEXTRIN/KETOPROFEN
3.1.1 Phương pháp khuấy từ
3.1.1.1 Khảo sát tỷ lệ giữa ketoprofen và β-cyclodextrin
Bảng 3 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ ketoprofen:β-cyclodextrin đến hiệu suất tạo
phức β-cyclodextrin/ketoprofen Tỷ lệ ketoprofen: β-cyclodextrin Thời gian (phút) Nhiệt độ (°C)
Hiệu suất (%) Hiệu suất
TB (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 1:1 1:5 1:8 1:10 60 100 50,00 68,89 77,78 75,56 53,33 67,78 78,89 77,78 51,11 71,11 78,89 76,67 51,48 69,26 78,52 76,67
Hình 10 Đồ thị biểu diễn hiệu suất phức β-cyclodextrin/ketoprofen thu được
theo tỷ lệ ketoprofen:β-cyclodextrin
Kết quả sau khi xử lý số liệu bằng phần mềm thống kê Statgraphics.
ANOVA Table for “Hiệu suất” by “Tỷ lệ ketoprofen:β-cyclodextrin”
Source Sum of Squares Df Mean Square F-ratio P-value Fcrit
Between groups Within groups Total (Corr.) 1369,43 14,7852 1384,21 3 8 11 456,476 1,84815 246,99 32.10-9 4,07
Multiple Range Tests (Method: 95,0 percent LSD)
Tỷ lệ ketoprofen:β-cyclodextrin Count Mean Homogeneous Groups
1:1 1:5 1:10 1:8 3 3 3 3 51,48 69,26 76,67 78,52 c b a a
Contrast Difference +/- Limits
1:1 – 1:5 1:1 – 1:8 1:1 – 1:10 1:5 – 1:8 1:5 – 1:10 1:8 – 1:10 *-17,78 *-27,04 *-25,19 *-9,26 *-7,41 1,85 2,55967 2,55967 2,55967 2,55967 2,55967 2,55967
(*: Khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê; a: hạng nhất, b: hạng nhì, c: hạng ba, các trị số có cùng ký tự trong một cột thì không khác biệt nhau về thống kê (ở P < 0,05, Duncan’s Test))
Hình 11 Sản phẩm phức β-cyclodextrin/ketoprofen
Nhận xét
Kết quả phân tích ANOVA cho thấy F-ratio = 246,99 >> Fcrit = 4,07 và P-value = 32.10-9 << 0,05; điều này chứng tỏ tỷ lệ ketoprofen:β-cyclodextrin ảnh