3.5.1 Chuẩn bị mẫu đo SEM và đo TEM
Các mẫu nano β-cyclodextrin–alginate và nano β-cyclodextrin–alginate– ketoprofen được tổng hợp đến giai đoạn tách ly tâm (đã qua ly tâm). Lấy 1 mL mẫu nano sau khi ly tâm pha loãng với nước khử ion theo tỷ lệ mẫu:nước = 1:1, dung dịch được pha loãng này đem lọc qua màng lọc. Sau đó, đem đo SEM (kính hiển vi điện tử quét) và TEM (kính hiển vi điện tử truyền qua).
3.5.2 Đặc điểm cấu trúc và hình dạng của nano β-cyclodextrin–alginate alginate
Hình 22 Ảnh SEM của β-cyclodextrin (a.), alginate (b.) và
nano β-cyclodextrin–alginate (c.)
Kết quả đo SEM cho thấy β-cyclodextrin và alginate đều có kích thước µm nhưng khi kết hợp với nhau thì tạo thành sản phẩm có kích thước nm (Hình 22). Hạt nano β-cyclodextrin–alginate thu được có kích thước hạt nhỏ hơn 100 nm và kích thước của các hạt nano thu được khá đồng đều (Hình 22c).
3.5.3 Đặc điểm cấu trúc và hình dạng của nano β-cyclodextrin–alginate–ketoprofen alginate–ketoprofen
Kết quả đo SEM cho thấy hạt nano β-cyclodextrin–alginate–ketoprofen tổng hợp được có kích thước dưới 100 nm và kích thước của các hạt nano khá đồng đều
(Hình 23a).
Hình 23 Ảnh SEM (a.) và TEM (b.) của nano β-cyclodextrin–alginate–ketoprofen
Quan sát ảnh TEM của nano β-cyclodextrin–alginate–ketoprofen tổng hợp được (Hình 23b) nhận thấy các hạt nano là những hạt có kích thước khoảng 60-70 nm.
3.6 CÁC PHỔ IR
3.6.1 Phổ IR của β-cyclodextrin, phức β-cyclodextrin/ketoprofen, ketoprofen ketoprofen
Hình 24 Phổ IR của β-cyclodextrin, phức β-cyclodextrin/ketoprofen, ketoprofen
Phổ IR của β-cyclodextrin (Phụ lục 2)
Phổ IR của β-cyclodextrin được trình bày ở hình 24 cho thấy nhóm OH có tần số dao động hấp thu ở 3376 cm-1.
Phổ IR của ketoprofen (Phụ lục 7)
Quan sát phổ IR của ketoprofen (Hình 24) cho thấy mũi dao động C=O của nhóm acid và nhóm ketone lần lượt là 1697 cm-1 và 1655 cm-1.
Hình 24 biểu diễn phổ IR của phức β-cyclodextrin/ketoprofen. Kết quả phổ IR cho thấy mũi dao động C=O của nhóm acid và nhóm ketone lần lượt là 1733 cm-1 và 1665 cm-1. Như vậy, mũi dao động C=O của nhóm acid dịch chuyển từ 1697 cm-1 đến 1733 cm-1 (khoảng 36 cm-1). Mũi dao động C=O của nhóm ketone dịch chuyển từ 1655 cm-1 đến 1665 cm-1 (khoảng 10 cm-1). Sự dịch chuyển hai mũi dao động C=O do tương tác giữa nhóm carboxylic của ketoprofen với hydroxyl trên β-cyclodextrin làm thay đổi tần số dao động C=O. Thêm vào đó nhóm hydroxyl (-OH) như là một mũi rộng hấp thu ở bước sóng 3367 cm-1.
3.6.2 Phổ IR của alginate, β-cyclodextrin, nano β-cyclodextrin–alginate, nano β-cyclodextrin–alginate–ketoprofen, ketoprofen alginate, nano β-cyclodextrin–alginate–ketoprofen, ketoprofen
Phổ IR của alginate (Phụ lục 1)
Phổ IR của alginate được trình bày ở hình 25 cho thấy mũi dao động ở 1032 cm-1 tương ứng với C-O-C đặc trưng cho cấu trúc saccharide của sodium alginate. Thêm vào đó peak ở 1617 cm-1 và 1418 cm-1 được ấn định đối với dao động hấp thu của nhóm carboxylate bất đối xứng và đối xứng của muối (-COO-).
Phổ IR của nano β-cyclodextrin–alginate (Phụ lục 5)
Phổ IR của nano β-cyclodextrin–alginate (Hình 25) cho thấy mũi dao động của nhóm -COO- bất đối xứng và đối xứng lần lượt là 1608 cm-1 và 1420 cm-1. Như vậy, dao động của nhóm COO- bất đối xứng dịch chuyển từ 1608 cm-1 đến 1617 cm-1
(khoảng 9 cm-1) và mũi dao động của nhóm -COO- đối xứng dịch chuyển từ 1418 đến 1420 cm-1 (khoảng 2 cm-1). Bên cạnh đó, nhóm hydroxyl (-OH) như là một mũi rộng hấp thu ở bước sóng 3390 cm-1. Ngoài ra, mũi dao động hấp thu ở khoảng 1292 cm-1 là dao động của nhóm Ca-O.
Phổ IR của nano β-cyclodextrin–alginate–ketoprofen (Phụ lục 6)
Kết quả phổ IR của nano β-cyclodextrin–alginate–ketoprofen (Hình 25) cho thấy mũi dao động C=O của nhóm acid và ketone xuất hiện lần lượt là 1695 cm-1 và 1655 cm-1. Như vậy, mũi dao động C=O của nhóm acid dịch chuyển từ 1695 cm-1 đến 1697 cm-1 (khoảng 2 cm-1). Bên cạnh đó, mũi dao động của nhóm -COO- bất đối xứng là 1606 cm-1 (trong khi đó ở alginate là 1617 cm-1, dịch chuyển khoảng 11 cm-1). Do trong phân tử ketoprofen có nhóm rút C=O nên làm cho độ hấp thu chiều dài bước
sóng của nhóm -COO- dịch chuyển. Điều đó chứng rằng ketoprofen đã đi vào mạng lưới polymer của nano β-cyclodextrin–alginate. Hơn nữa, mũi dao động của nhóm Ca- O xuất hiện ở peak khoảng 1285 cm-1 (trong khi ở phổ IR của nano β-cyclodextrin– alginate là 1292 cm-1, dịch chuyển khoảng 7 cm-1).
Hình 25 Phổ IR của alginate, β-cyclodextrin, nano β-cyclodextrin–alginate, nano
β-cyclodextrin–alginate–ketoprofen và ketoprofen
3.7 ĐỊNH TÍNH KETOPROFEN
Ketoprofen trong phức β-cyclodextrin/ketoprofen và nano β-cyclodextrin– alginate–ketoprofen được xác định bằng phương pháp sắc ký bản mỏng TLC.
3.7.1 Định tính ketoprofen trong mẫu phức β-cyclodextrin/ketoprofen
Phương pháp định tính
Chuẩn bị dung dịch ketoprofen chuẩn: Thêm 10 mg ketoprofen vào 5 mL diethyl ether thu được dung dịch ketoprofen dùng làm mẫu chuẩn. Chuẩn bị 1 mL dung dịch này, rồi dùng ống mao quản hút khoảng 1/2 ống chấm lên bản mỏng.
Chuẩn bị dung dịch mẫu thử: Thêm 100 mg mẫu phức β-cyclodextrin/ketoprofen vào 5 mL diethyl ether. Sau đó, lọc lấy dịch chiết. Chuẩn bị 1 mL dịch chiết này rồi dùng ống mao quản hút khoảng 1/2 ống chấm lên bản mỏng để chạy sắc ký, từ đó so sánh với vết chấm của dung dịch chuẩn.
Dung môi giải ly sử dụng là petroleum ether:ethyl acetate với tỷ lệ 1:1.
Chấm dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu thử lên cùng bản mỏng, chạy giải ly với hệ dung môi trên, rồi soi dưới đèn UV sẽ thấy xuất hiện các vết trên bản mỏng. Sau khi chấm lên bản mỏng, so sánh các vết chấm của dung dịch thử với vết chấm của dung dịch chuẩn khi soi dưới đèn UV.
Hình 26 TLC của mẫu ketoprofen chuẩn và mẫu thử
Kết quả chạy sắc ký bản mỏng của dung dịch mẫu thử và dung dịch ketoprofen chuẩn (Hình 26) cho thấy vết của dung dịch mẫu thử xuất hiện ngang bằng với vết của dung dịch ketoprofen chuẩn trên bản mỏng. Điều này chứng tỏ rằng trong mẫu phức β-cyclodextrin/ketoprofen thu được chứa lượng ketoprofen.
3.7.2 Định tính ketoprofen trong mẫu nano β-cyclodextrin–alginate–
ketoprofen
Phương pháp chuẩn bị dung dịch ketoprofen chuẩn và dung dịch mẫu cần thử tương tự như trường hợp định tính ketoprofen trong mẫu phức.
Hình 27 TLC của mẫu ketoprofen chuẩn và mẫu thử
Hình 27 biểu diễn kết quả sắc ký bản mỏng của dung dịch mẫu thử và dung dịch ketoprofen chuẩn. Kết quả cho thấy vết của dung dịch mẫu thử xuất hiện ngang bằng với vết của dung dịch ketoprofen chuẩn trên bản mỏng. Do đó có thể kết luận rằng trong mẫu nano β-cyclodextrin–alginate–ketoprofen tổng hợp được có sự hiện diện của ketoprofen.
3.8 XÁC ĐỊNH NHIỆT CHUYỂN PHA
Nhiệt chuyển pha của phức β-cyclodextrin/ketoprofen và nano β-cyclodextrin– alginate–ketoprofen được xác định bằng phương pháp phân tích nhiệt quét vi sai DSC.
3.8.1 Phân tích nhiệt quét vi sai phức β-cyclodextrin/ketoprofen
3.8.1.1 Phương pháp nghiên cứu
Cân chính xác 10 mg mẫu phức β-cyclodextrin/ketoprofen ở dạng bột mịn vào chén đo mạ vàng.
Điều kiện đo: quét nhiệt từ 30-350°C. Tốc độ gia nhiệt 10°C/phút. Khí nitrogen có tốc độ dòng là 25 mL/phút. Xác định được nhiệt chuyển pha. Nếu đo lại lần 2 thì để yên chén đo, ổn định nhiệt độ phòng trong 3 giờ. Sau đó tiến hành quét lại với cùng điều kiện như các mẫu trên.
Hình 28 Giản đồ DSC của phức β-cyclodextrin/ketoprofen
Thực hiện nghiên cứu phức β-cyclodextrin/ketoprofen bằng nhiệt quét vi sai
(Hình 28) cho thấy đỉnh thu nhiệt của ketoprofen là 129,7°C; đỉnh thu nhiệt của β-cyclodextrin là 297,3°C.
3.8.2 Phân tích nhiệt quét vi sai nano β-cyclodextrin–alginate–ketoprofen ketoprofen
3.8.2.1 Phương pháp nghiên cứu
Thực hiện tương tự như trường hợp định tính ketoprofen trong phức β-cyclodextrin/ketoprofen.
Hình 29 Giản đồ DSC của nano β-cyclodextrin–alginate–ketoprofen
Thực hiện nghiên cứu nano β-cyclodextrin–alginate–ketoprofen bằng nhiệt quét vi sai (Hình 29) cho thấy đỉnh thu nhiệt của ketoprofen là 127,9°C; đỉnh thu nhiệt của alginate là 227,5°C và đỉnh thu nhiệt của β-cyclodextrin là 268,2°C.
Qua kết quả phân tích DSC của phức β-cyclodextrin/ketoprofen và nano β-cyclodextrin–alginate–ketoprofen (Hình 28, 29) cho thấy đỉnh thu nhiệt của ketoprofen và β-cyclodextrin có trong nano thấp hơn so với trong phức lần lượt là 1,8°C và 29,1°C, do sự có mặt của alginate trong nano nên làm giảm đỉnh thu nhiệt của ketoprofen và β-cyclodextrin.
3.9 ĐỊNH LƯỢNG KETOPROFEN
Định lượng ketoprofen trong các mẫu nano β-cyclodextrin–alginate–ketoprofen đã tổng hợp được bằng phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Chuẩn bị dung dịch phân tích
Pha động: 1000 mL pha động bao gồm 180 mL methanol, 270 mL acetonitril và 550 mL dung dịch amonium acetate 0,5 mg/mL.
- Thêm 20 mg ketoprofen vào 5 mL methanol cho được dung dịch ketoprofen 4 mg/mL dùng làm mẫu chuẩn. Chuẩn bị 1 mL mẫu chuẩn này và trước khi bơm vào máy mẫu đã được lọc qua màng milipore.
- Chuẩn bị 1 mL mẫu chuẩn tương tự như trên cho các hàm lượng 2 mg/mL, 1 mg/mL và 0,5 mg/mL.
Bảo quản các dung dịch này ở nhiệt độ không quá 25°C và tránh ánh sáng. Chuẩn bị dung dịch đo mẫu
Ngâm 100 mg các mẫu nano β-cyclodextrin–alginate–ketoprofen nồng độ 5%, 10%, 12% trong 5 mL diethyl ether khoảng 1-2 giờ để chiết ketoprofen có trong mẫu.
Nước lọc mẫu được đuổi dung môi thu một chất rắn. Pha chất rắn trong 1 mL methanol và lọc dịch methanol qua màng milipore trước khi bơm vào máy.
Kết quả chạy HPLC
Bảng 11 Kết quả chạy HPLC của dung dịch ketoprofen chuẩn
Nồng độ ketoprofen (mg/mL) Diện tích peak (%)
0,5 1 2 4 44,44 50,42 63,95 71,74
Hình 31 Kết quả chạy HPLC của ketoprofen chuẩn ở các nồng độ 0,5, 1, 2 và 4 mg/mL
Bảng 12 Kết quả chạy HPLC của dung dịch mẫu
Hàm lượng ketoprofen trong các mẫu nano (%) Diện tích peak (%)
5 10 12 62,94 73,53 76,19
Kết quả phân tích HPLC đối với dịch chiết diethyl ether thu từ các mẫu nano đã tổng hợp đều thấy xuất hiện peak của ketoprofen (Hình 32). Kết quả các mẫu phân tích HPLC có lượng ketoprofen phóng thích là 2%, 4,5% và 5% tương ứng với lượng ketoprofen 5%, 10% và 12% đã dùng trong tổng hợp các mẫu nano β-cyclodextrin– alginate–ketoprofen.
3.10 KHẢ NĂNG PHÓNG THÍCH THUỐC45
Chuẩn bị dung dịch đệm pH = 5,0 và pH = 7,4
Thêm 27,8 g NaH2PO4 vào 1000 mL nước khử ion và 71,1 g Na2HPO4.12H2O vào 1000 mL nước khử ion.
Pha dung dịch có pH = 5,0: Cho 1 mL dung dịch Na2HPO4 vào 150 mL dung dịch NaH2PO4, thu được dung dịch có pH = 5,0 (điều chỉnh bằng máy điều chỉnh pH).
Pha dung dịch có pH = 7,4: Cho 81 mL dung dịch Na2HPO4 vào 19 mL dung dịch NaH2PO4 thu được dung dịch có pH = 7,4.
Dung dịch phân tích và dung dịch chuẩn được chuẩn bị tương tự như trường hợp định tính ketoprofen bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.
Chuẩn bị dung dịch đo mẫu
- Ngâm mẫu trong dung dịch có pH = 5,0.
Lấy 100 mg mẫu nano β-cyclodextrin–alginate–ketoprofen chứa hàm lượng ketoprofen là 10% cho vào 10 mL dung dịch có pH = 5,0, khuấy từ tốc độ 50 vòng/phút, nhiệt độ 37°C±1°C. Ngâm mẫu này khoảng 30 phút, gạn và thu lấy dung dịch 1. Sau đó, thêm tiếp 10 mL dung dịch pH = 5,0 vào rồi tiếp tục ngâm mẫu thêm 30 phút trước khi gạn và thu lấy dung dịch 2.
Tiếp tục cho 10 mL dung dịch pH = 5,0 vào mẫu và ngâm với thời gian 60 phút rồi gạn lấy dung dịch 3. Lặp lại quá trình trên nhưng với thời gian 60 phút mới thực hiện một lần.
Thu các dung dịch ở từng thời điểm khác nhau (dung dịch 1, dung dịch 2, …) rồi mỗi dung dịch này được chiết với 10 mL diethyl ether. Sau đó lớp hữu cơ được cô đuổi dung môi và thu một chất rắn. Cho chất rắn này vào 1 mL methanol. Dịch methanol được lọc qua màng milipore trước khi bơm vào máy HPLC.
- Ngâm mẫu trong dung dịch có pH = 7,4.
Chuẩn bị mẫu tương tự như trường hợp pH = 5,0. Kết quả đo độ phóng thích
Bảng 13 Kết quả đo độ phóng thích ketoprofen theo thời gian
Thời gian (giờ) 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0
Nồng độ ketoprofen (mg/mL) theo thời gian
pH = 5,0 pH = 7,4 1,9 0,5 3,8 1,6 5,5 2,7 6,6 5,1 6,9 5,7 Hình 33 Khả năng phóng thích thuốc ở pH = 5,0 và pH = 7,4
Kết quả phân tích khả năng phóng thích thuốc của các mẫu cho thấy lượng ketoprofen đã phóng thích ra ở pH = 5,0 sau 4 giờ là 69%; trái lại, trong cùng thời gian ở pH = 7,4 lượng ketoprofen phóng thích đạt 57%. Điều này chứng tỏ lượng ketoprofen phóng thích ở pH = 5,0 nhiều hơn ở pH = 7,4.
Chương 4
THỰC NGHIỆM
------
4.1 QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM
Pha chế hóa chất để phục vụ thí nghiệm.
Tổng hợp phức β-cyclodextrin/ketoprofen bằng phương pháp khuấy từ (khảo sát tỷ lệ ketoprofen:β-cyclodextrin, thời gian và nhiệt độ phản ứng) và phương pháp vi sóng (khảo sát công suất và thời gian phản ứng).
Tổng hợp nano β-cyclodextrin–alginate (khảo sát tỷ lệ β-cyclodextrin:alginate) và nano β-cyclodextrin–alginate–ketoprofen (khảo sát tỷ lệ β-cyclodextrin:alginate và hàm lượng ketoprofen).
Pha chế hóa chất để phục vụ thí nghiệm
Pha chế dung dịch CaCl2 (10,05 mg/mL)
Lấy 5025 mg = 5,025 g CaCl2 hòa tan vào 500 mL nước khử ion thu được 500 mL dung dịch CaCl2 (10,05 mg/mL).
Pha chế dung dịch sodium alginate (9,0 mg/mL)
Lấy 4500 mg = 4,5 g sodium alginate hòa tan vào 500 mL nước khử ion thu được 500 mL dung dịch sodium alginate (9,0 mg/mL).
Pha chế dung dịch β-cyclodextrin (2,4 mg/mL)
Lấy 1200 mg = 1,2 g β-cyclodextrin hòa tan vào 500 mL nước khử ion thu được 500 mL dung dịch β-cyclodextrin (2,4 mg/mL).
Pha chế dung dịch alcohol:nước (tỷ lệ alcohol:nước = 1:1)
Lấy 100 mL ethanol (C2H5OH) hòa tan vào 100 mL nước khử ion thu được 200 mL dung dịch alcohol:nước = 1:1.
Lấy 663 mg = 0,663 g ketoprofen hòa tan vào 200 mL dung dịch alcohol:nước đã được pha chế ở trên, ta được 200 mL dung dịch ketoprofen (3,315 mg/mL).
4.2 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
Các nghiệm thức được bố trí một cách ngẫu nhiên.
4.2.1 Tổng hợp phức β-cyclodextrin/ketoprofen
4.2.1.1 Phương pháp khuấy từ
Thí nghiệm 1Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ ketoprofen:β-cyclodextrin đến
hiệu suất tổng hợp phức β-cyclodextrin/ketoprofen
Thí nghiệm được thực hiện trên 4 nghiệm thức (tương ứng với các tỷ lệ ketoprofen:β-cyclodextrin là 1:1, 1:5, 1:8 và 1:10), mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, chọn ngẫu nhiên một mẫu trong nghiệm thức cho hiệu suất tổng hợp phức là cao nhất để đo IR.
Thí nghiệm 2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu suất
tổng hợp phức β-cyclodextrin/ketoprofen
Dựa vào kết quả khảo sát tỷ lệ ketoprofen:β-cyclodextrin (Thí nghiệm 1), chọn tỷ lệ tối ưu để khảo sát trên 4 nghiệm thức (tương ứng với các thời gian 30 phút, 60 phút, 90 phút và 120 phút), mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, chọn ngẫu nhiên một mẫu trong nghiệm thức cho hiệu suất tổng hợp phức là cao nhất để đo IR.
Thí nghiệm 3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hiệu suất
tổng hợp phức β-cyclodextrin/ketoprofen
Từ kết quả khảo sát thời gian phản ứng (Thí nghiệm 2), chọn thời gian tối ưu để khảo sát trên 4 nghiệm thức (tương ứng với các nhiệt độ 80°C, 100°C, 120°C và 140°C), mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, chọn ngẫu nhiên một mẫu trong nghiệm thức cho hiệu suất tổng hợp phức cao nhất để đo IR.
4.2.1.2 Phương pháp vi sóng
Thí nghiệm 4 Khảo sát ảnh hưởng của công suất đến hiệu suất tổng hợp
Dựa vào kết quả khảo sát tỷ lệ ketoprofen:β-cyclodextrin (Thí nghiệm 1), chọn tỷ lệ tối ưu để khảo sát trên 4 nghiệm thức (tương ứng với các công suất 200 W, 300 W, 450 W và 600 W), mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, chọn ngẫu nhiên một mẫu trong nghiệm thức cho hiệu suất tổng hợp phức cao nhất để đo IR.
Thí nghiệm 5 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu suất
tổng hợp phức β-cyclodextrin/ketoprofen
Sau khi khảo sát công suất (Thí nghiệm 4), chọn công suất tối ưu để khảo sát