6.1. Giới thiệu về enzyme papain
6.1.1. Đặc điểm chung
Papain là cysteine protease được biết đến nhiều nhất và được phân lập lần đầu tiên vào năm 1879 từ nhựa trái đu đủ (Carica papaya). Đây cũng là enzyme đầu tiên được xác định cấu trúc tinh. Trong nhựa đu đủ ngoài enzyme papain còn có các loại protease khác như chymopapain, caricain, glycyl endopeptidase và một số enzyme khác. Nhựa đu đủ có hàm lượng và hoạt tính papain cao nhất tập trung ở vùng có nắng nóng và độ ẩm ổn định quanh năm.
- Cysteine proteases là nhóm các protein có trọng lượng phân tử trong khoảng 21-30kDa, các protein này có khả năng xúc tác để thủy phân các loại liên kết: peptide, amide, esterthiol. Đây cũng là những enzyme có nhóm –SH trong tâm hoạt động.
- Người ta đã tìm thấy hơn 20 họ cysteine proteases (Barrett, 1994) và nhiều enzyme trong số này (papain, bromelain, ficain, animal cathepsins) được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp.
- Có 2 loại cysteine proteases là exopeptidase ( cathepsin X, carboxypeptidase B) và endopeptidases (bromelain, ficain, cathepsin…). Exopeptidase thủy phân liên kết peptide ở đầu N hoặc đầu C tự do trong khi đó endopepetidase cắt đứt các liên kết peptide ở giữa chuỗi polypeptide.
Nhựa cây đu đủ nằm trong các ống dẫn nhựa trải rộng khắp toàn bộ cây, ngoại trừ rễ. nhựa là hỗn hợp enzyme chứa các protease sau: papain, chymopapain A( gốc amino acid cuối là glutamic acid), chymopapain B (gốc amino aicd là tyrosine), proteinase III, proteinase IV, thilprotesase, trong đó papain chiếm tới 95%.
Tính chất vật lý Giá trị Điểm đẳng điện pI = 8.75 Hằng số sa lắng S20 2.42 ± 0.04 Hằng số phân tán D20 (10-7giây.cm2) 10.27 ± 0.13 Phân tử lượng 20,700 Độ triền quang [α]D -66.70 Độ xoắn 17% Vòng hiệu ứng cotton 290nm Thể tích riêng phần V(mL/g) 0.724 Trị số ma sát f/fo 1.16
Bột màu vàng hay màu nâu nhạt, tùy thuộc phương pháp sấy, không tan trong hầu hết các chất hữu cơ nhưng tan một phần trong H2O hay glycerine. Bền nhiệt.
6.1.3.Tính chất hóa học
Cấu tạo hóa học
Papain là 1 endoprotease có chứa 16% N và 1.2% S. Papain là 1 protease thiol, theo nghiên cứu của R. L. Hill và E. L Smith, papain là 1 chuỗi polypeptide gồm 185 amino acid, trọng lượng phân tử là 20.900 Dalton.
Bảng 6.1: Thành phần hóa học của papain
Amino acid Số lượng Amino acid Số lượng
Alanine 13 Lyeine 9
Arginine 10 Proline 4
Aspartic acid 17 Serine 9
Half – Cysteine 6 Threonie 11
Glutamid acid 17 Tryptophan 7
Glycine 23 Tyrosine 5
Histidine 2 Valine 17
Isoleucine 10 Methionine 15
Leucine 10 0
Tổng cộng: 185
Theo kết quả phân tích bằng tia X, phân tử papain được cấu tạo bởi 212 acid amin trong đó không có chứa methionine. Phân tử lượng khoảng 23,350 Da, phân tử là một mạch polypeptide với đầu N là isoleucine, đầu C là asparagine, có 6 gốc cysteine tạo thành 3 cầu disulfur ở các vị trí 22-63, 56-95, 153-200 không có chức năng sinh học, chỉ làm tăng tính bền vững của cấu trúc và một nhóm –SH tự do ở vị trí 25.
Phân tử papain có dạng hình cầu với kích thước 36x48x36Ao và mạch chính bị gấp thành hai phần riêng biệt bởi một khe. Trung tâm hoạt động nằm tại bề mặt của khe này, nhóm -SH hoạt động của cysteine 25 nằm bên trái khe và nhóm histidine 159 nằm bên phải khe. Phần xoắn chiếm 20% toàn bộ các amino acid có trong phân tử.
Hình 6.1: Cấu trúc bậc 3 của papain
Hoạt tính của papain dựa trên hai tâm hoạt động là Cys 25 và His159. Khoảng pH hoạt động của papain khá rộng (3.5 – 8.0) tùy thuộc vào cơ chất. Khi cơ chất là casein thì hoạt tính tối ưu của papain trong vùng pH từ 5.7 – 7.0 và nhiệt độ thích hợp là 50 – 570C.
Cấu trúc tâm hoạt động của papain:
- Tâm hoạt động của papain gồm có nhóm –SH của cysteine 25 và nitrogen bậc 3 của histidine 159. Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởi liên kết hydrogen.
- Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các amino acid là: Lys-Asp-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys.
- Theo các nghiên cứu của Lowe, chuỗi polypeptide trong trung tâm hoạt động của papain gần giống như của ficin hay trypsin, mặc dù chúng có nguồn gốc khác nhau. Ficin: Arg-Glu-Glu-Gly-Glu-Cys-Gly-Ser-Cys.
Hình 6.2: Cấu trúc tâm hoạt động của papain
Hoạt tính enzyme và cơ chất tác dụng:
- Papain thủy phân protein thành các polypeptide và các polypeptide và các amino acid, đóng vai trò vừa như endopeptidase vừa như exopeptidase.
- Các endopeptidase thủy phân protein chủ yếu thành các peptid:
(-NH-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-)n + HOH (-NH-CH(R)-COOH)I + (H2N- CH(R)- CO-)k
i+k=n
- Các exopeptidase thủy phân các peptide thành các amino acid
(H2N-CH(R )-CO-NH-CH(R )-CO-)n + HOH (H2N-CH(R)-COOH)n` + (H2N- CH(R)-CO-)k
n`+k = n
- So với các protease có nguồn gốc động vật và vi sinh vật khác thì papain có khả năng thủy phân sâu hơn. Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng vì nó có khả năng phân hủy hầu hết các liên kết peptide trừ các liên kết với proline và các glutamic acid có nhóm carboxy tự do. Papain có thể nhận biết 1 chuỗi gồm 7 amino aicd trên cơ chất peptide của mình và sẽ ưu tiên cắt liên kết peptide trên 1 chuỗi có phenylamine như sau: nếu peptide có dạng X-Phe-Y-Z (X, Y, Z là các gốc amino acid) thì papainsex cắt tại vị trí giữa Y và Z, nhưng nếu peptide có dạng X-Phe-Y (có Phe nằm ở vị trí thứ 2 trước đầu tận cùng) thì không được thủy phân bởi papain.
- Ngoài ra papain còn có hoạt tính esterase, thiolesterase và traferase. Hoạt hóa papain
Papain chỉ thể hiện hoạt tính xác tác của mình khi nhóm –SH ở dạng tự do. Vì vậy ta sử dụng chất hoạt hóa để đưa papain từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động. Do trung tâm hoạt động của papain có tính khử nên các chất hoạt hóa là các chất có tính khử như cysteine, glytation aicd, hdrocyanic… trong đó cysteine là chất hay dùng nhất. Khi có mặt các chất này thì nhóm –SH của papain được phục hồi và làm tăng hoạt tính papain. Để thu được hoạt tính cao nhất thì thích hợp là dùng hỗn hợp cysteine và EDTA, trong đó cysteine đóng vai trò là chất hoạt hóa papain, còn EDTA đóng vai trò chất liên kết tạo phức với ion kim loại nặng có trong nhựa đu đủ.
Bất hoạt
- Papain bị kìm hãm (ức chế bất thuận nghịch) bởi các chất oxy hóa như: O2, O3, H2O2, iodur acetate, cysteine và các hợp chất disufur khác. Các chất này phản ứng với nhóm –SH ở trung tâm hoạt động của papain làm phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó. - Papain bị bất hoạt thuận nghịch bởi không khí, cysteine ở nồng độ thấp. papain tác dụng với chloromethul cetone của Phe và Lys thì mất hoàn toàn hoạt tính. Tuy nhiên papain lại rất bền với các tác nhân biến tính là dung môi hữu cơ ( độ quay cực của papain hầu như không biến đổi trong ethanol 70% hay urea 6-8m).
Phản ứng của papain
Papain thủy phân protein thành các polypeptide và các acid amin, nó đóng vai trò vừa như endopeptidase vừa như exopeptidase.
Hình 6.3: Phản ứng hóa học của papain
Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain
Nhiệt độ: Papain là enzyme chịu được nhiệt độ tương đối cao. Ở dạng nhựa khô
papain không bị biến tính trong 3 giờ ở 1000C. Còn ở dạng dung dịch papain bị mất hoạt tính sau 30 phút ở 82.50C và nếu nhiệt độ tăng cao hơn (>1000C) thì nó sẽ bị mất hoàn toàn hoạt tính kể cả khi thêm lượng lớn chất hoạt hóa vào dung dịch.
Điều này là do ở dạng dung dịch khi tăng lên đến nhiệt độ lớn hơn 1000C thì cấu trúc tâm hoạt động của papain bị phá hủy hoàn toàn. Điều đáng lưu ý là sau khi đã được tinh sạch và ở trạng thái tinh thể thì papain có độ bền nhiệt thấp hơn papain ở trong nhựa, do trong nhựa còn chứa các protein khác có tác dụng bảo vệ papain.
Papain trong dung dịch NaCl giữ ở 40C bền trong nhiều tháng. Trong dung dịch dẫn xuất thủy ngân, papain cũng không mất hoạt tính trong nhiều tháng. Trong khi đó hầu hết các enzyme mất hoạt tính mỗi ngày 1-2% do sự phân hủy hoặc oxy Khi thủy phân các protein khác nhau, thì tùy thuộc vào cơ chất mà nhiệt độ thích hợp cho papain cũng khác nhau chẳng hạn đối với cơ chất là casein thì nhiệt độ tối ưu cho phản ứng là 370C. Papain dạng ổn định ở trạng thái khô có thể chịu nhiệt độ sấy ở 1150C trong thời gian 2 giờ mà hoạt tính vẫn duy trì được 90%.
pH
: Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4.5-8.5 nhưng lại dễ
biến tính trong môi trường acid có pH < 4.5 hoặc trong môi trường kiềm mạnh có pH > 12. Khi phản ứng với cơ chất thì tùy thuộc vào bản chất của cơ chất mà pH tối ưu sẽ
khác nhau. Chẳng hạn, papain phản ứng với casein ở pH tối ưu là 7-7.5. Papain dạng ổn định tức là dạng mà cấu trúc không gian của enzyme được ổn định, có thể chịu được các pH = 1.5 và pH = 8.5 trong 90 phút.
Dung môi: Papain không thay đổi độ quay quang học trong dung môi là
methanol 70% và không thay đổi độ nhớt trong dung môi methanol 50%. Trong dung dịch dimethylsulfoxide chứa 20% dung môi hữu cơ và urea 8M không làm giảm hoạt tính cũng như thay đổi cấu hình của papain. Các chất gây biến tính mạnh như TCA 10%, guanidine hydrochloride 6M làm biến đổi bất thuận nghịch về độ quay quang học và hoạt tính của papain.
6.2. Phương pháp thu nhận papain:
Nguyên liệu 180g nhựa đu đủ Nghiền Trích ly Lọc Chỉnh pH Lọc
Kết tủa phân đoạn 1
Ly tâm 1 Kết tủa phân đoạn 2
Ly tâm 2 Kết tinh Tái kết tinh Sấy chân không
Papain. Celite(100g) Cát sạch(150g) Bã Bã 110mlNaOH 1M Tủa xám (NH4)2SO4 Dịch lỏng Dịch lỏng 60g NaCl rắn dd NaCl bão hòa 200-300m dd cysteine 0.04M pH: 5.7
Thời gian : 1-2 giờ 400-500ml (NH4)2S04
pH : 7-7.5 Thời gian : 1 giờ
pH : 6.5
Thời gian : 30 phút t : 370C
6.2.1. Thu nhận nhựa đu đủ
Nhựa cây đu đủ nằm trong các ống dẫn nhựa trải rộng khắp toàn bộ cây, ngoại trừ rễ. nhựa là hỗn hợp enzyme chứa các protease sau: papain, chymopapain A (gốc amino acid cuối là glutamic acid), chymopapain B(gốc amino aicd là tyrosine), proteinase III, proteinase IV, thilprotesase, trong đó papain chiếm tới 95%.
6.2.2. Thu nhận papain
Chuẩn bị:
Do trong nhựa đu đủ ngoài papain, chymopapain còn có 1 số enzyme, protein, chất nhựa, chất cao su, chất béo và các tạp chất khác để có được quy trình tách và làm sạch papain từ nhựa đu đủ có hiệu quả thì có quy trình hòa tan nhựa đu đủ nhằm loại bỏ tạp chất. cách làm như sau:
Trộn 180g nhựa đu đủ với 100g cetile và 150g cát sạch, nghiền kĩ trong cối ở nhiệt độ phòng với 200-300mL dung dịch cysteine 0.04M (hòa tan 6.3g cysteine hydrochloride trong 1000mL dung dịch NaOH 0.054M, kiềm được sử dụng để đư pH dịch chiết tới 5.7)
Khi nhựa tạo thành thể huyền phù thì gạn bỏ lớp nổi ở trên. Quá trình nghiền và trích được lặp lại với 300mL dung dịch cysteine. Rửa cối với dung dịch cysteine để điều chỉnh thể tích chiết lên 11.
Dịch huyền phù sau cùng được lọc lạnh (có thể hút nhẹ) trên giấy lọc Whatman số 1, thời gian lọc có thể rất dài. Nước lọc có màu trắng sữa hoặc vàng xanh, pH gần 5.7.
Các bước còn lại của quá trình tinh sạch enzyme được tiến hành trong điều kiện lạnh.
Loại bỏ các chất không tan pH 9:
Thêm từ từ và khuấy đều 1 lượng khoảng 110ml dung dịch NaOH 1M để điều chỉnh pH của dịch chiết thu được ở trên lên pH 9. Lọc hoặc ly tâm ở 2600 vòng/phút trong 1 giờ để loại bỏ tủa xám tạo thành (tủa gây biến tính protein), thu dịch trích trong. Quá trình phân đoạn bằng ammonium sulfate (NH4)2SO4:
Cho (NH4)2SO4 vào dịch enzyme đến 40% độ bão hòa, sau 1-2 giờ, ly tâm ở 2500 vòng/ phút. Thu nhận tủa, bỏ dịch lỏng hoặc có thể giữ lại lấy chymopapain. Tủa được rửa lại 1 lần nữa với 400-500ml dung dịch (NH4)2SO4 40% độ bão hòa.
Quá trình phân đoạn bằng NaCl:
Hòa tan trong 600mL dung dịch cysteine 0.02M, dung dịch thu được có pH 7- 7.5 sau đó thêm từ từ 60g NaCl rắn. Sau 1 giờ, ly tâm ở 2500 vòng/phút trong 1 giờ để thu tủa, bỏ dich lỏng.
Kết tinh:
Hòa tan tủa với 400mL dung dịch cysteine 0.002M ở nhiệt độ phòng được 1 dung dịch huyền phù có pH = 6.5. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để tinh thể tạo thành, duy trì ở 40C qua đêm, sau đó ly tâm lạnh ở 2500 vòng/ phút trong 4-5 giờ để thu nhận tinh thể.
Tái kết tinh:
Hòa tan tinh thể thu được ở bước trên trong nước cất nhiệt độ phòng tạo dung dịch có nồng độ protein khoảng 1%. Sau đó cho vào từ từ ( đồng thời khuấy đều) dung dich NaCl bão hào ( 10mL/ 300mL dung dịch protein). Khi 75% thể tích dung dịch NaCl đã cho vào, papain bắt đầu kết tinh ở nhiệt độ phòng. Dịch huyền phù được giữ ở 40C qua đêm, sau đó ly tâm lạnh 2500 vòng/ phút trong 4-5 giờ thu nhận tinh thể. Hoạt động riêng của enzyme có thể tăng nhẹ nếu tiến hành tái kết tinh thêm 1 lần nữa như trên.
Để tăng hoạt tính enzyme, trước khi tái kết tinh có thể hòa tan tinh thể papain trong dung dịch đệm phosphate chứa cysteine, sau đó tiến hành siêu lọc với màng lọc 4000A0 và đem kết tinh dịch lỏng thu được sau siêu lọc.
Sấy chân không:
Sấy chân không ở nhiệt độ 400C thu nhận papain tinh chế.
6.2.3. Phương pháp tinh sạch papain:
Điện di:
Sử dụng gel polyacrylamide 12%, dung dịch đệm là beta-alanine 34mM, pH = 4.3 và cường độ dòng điện không đổi là 4mM. mẫu sẽ được chuẩn bị trong Tris-
glycerol-beta-mercatoethanol cho vào nước sôi trong 40 giây. Gel sẽ được hiện màu bằng thuốc thử Coomassie-Blue R-250 và Brilliant Blue G-colloidal.
6.2.4. Lọc qua Sephadex G-75
Để xác định phân tử lượng của papain, ta dùng cột Sephadex G-75 có kích thước cột là 1.1x100 cm. cột được cân bằng trước dung dịch đệm gồm sodium phosphate 0.1M và dung dịch EDTA (ethylenediamine-tetraacetic aicd) pH=7.
7. GIỚI THIỆU VỀ ENZYME AMYLASE VÀ CÁCH THU NHẬN TỪ THỰC VẬT
7.1. Enzyme Amylase là gì ?
Amylase là một hệ Enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các Enzyme này thuộc nhóm Enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên polysaccharide với sự tham gia của nước.
RR’ + H-OH -> RH + R’OH
Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và dextrin hạn chế. Các Enzyme Amylase có trong nước bọt (ptyalin), trong dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm sợi, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn. Trong nước bọt của người có ptyalin nhưng ở một số loại động vật có vú thì không có như ngựa, chó, mèo... Ptyalin bắt đầu thủy phân tinh bột từ miệng và quá trình này hoàn tất ở ruột non nhờ Amylase của tuyến tụy (amylopsin). Amylase của malt thủy phân tinh bột lúa mạch thành disaccharide làm cơ chất cho quá trình lên men bởi nấm men.
Amylase là một trong những loại Enzyme được ứng dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y tế, và nhiều lĩnh vực kinh tế khác, đặc biệt là trong ngành công nghiệp thực phẩm.
7.2. Lịch sử phát hiện
1814: Kirchoff, Saint Petercburg chứng minh hạt lúa mạch nảy mầm có tác dụng chuyển hóa tinh bột thành đường ở nhiệt độ từ 4000C – 6000C.
1833: Payen và Perso (Pháp) thêm cồn vào dịch chiết này, thu được kết tủa có khả năng phân giải tinh bột thành đường, và đặt tên là Diastase (xuất phát từ tiếng Hy Lạp, diastatics, có nghĩa là phân giải, đó là Amylase). Sau này theo đề nghị của Duclo, Enzymephân giải tinh bột được gọi là Amylase.
1851: Leuchs đã phát hiện nước bọt cũng có khả năng phân giải tinh bột thành đường. Sau đó, các Enzyme Amylase trong nước bọt, trong dịch tiêu hóa của người và