4. GIỚI THIỆU ENZYME BROMELIN VÀ CÁCH THU NHẬN TỪ DỨA
4.3.2. Phương pháp tinh sạch
Enzyme bromelin được tinh sạch bằng phương pháp thẩm tích, lọc qua sephadex, phương pháp sắc kí.
Tinh sạch bằng phương pháp thẩm tích
Cân 1g enzyme thô, pha trong 100ml dung dịch đệm sodium phosphate 0.03M có pH 7.2. Sau khi tất cả enzyme đã hòa tan thì cho hỗn hợp vào túi cellophane rồi đặt túi vào cốc có chứa 1 lít dung dịch đệm sodium phosphate 0.03M , pH 7.2. Túi cellophane đực chuẩn bị bằng cách trước khi dùng được tráng đầy bằng dung dịch đệm tương tự trên. Tiến hành thẩm tích trong 6 gờ và cứ sau 2 giờ thay đổi đệm bên ngoài 1 lần. Dung dịch đệm phái ngoài túi được khuấy liên tục bằng 1 mày khuấy từ.
Trong quá trình thẩm tích, khi thay đồi nhiệt độ trong 1 giới hạn nhất định thì vận tốc khếch tán sẽ tăng theo sự gia tăng nhiệt độ. Nhưng nếu sự gia tăng nhiệt độ vượt quá mức cho phép thì protein enzyme bị biến tính do nhiệt độ cao làm ảnh hưởng đến những mối tương tác giúp cho sự ổn định cấu trúc enzyme. Chính vù vậy để làm giảm sự biến tính của enzyme do nhiệt , người ta thường tinh sạch enzyme ở nhiệt độ thấp.
Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex
• Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex G-50
Saphadex G-50 được đun cách thủy ở 100oC trong 1 giờ rồi nhồi vào cột kích thước (kích thước cột 23.5 x 0.9 cm). Đặt 1 cái phểu thủy tinh phía trên cột m cho sephadex từ từ vào phễu và khuấy liên tục. Các hạt sẽ lắng từ từ xuống cột , chú ý phải khuấy liên tục đến khi nhồi xong cột. Khi nhồi cột phải cố gắng nhồi sao cho mật độ hạt đồng nhất và ko có bọt khí. Trong quá trình nhồi cột vẩn phải xả cột trong 1 giờ với vận tốc 1ml/7 phút.
Cân 100mg enzyme thô vào trong 1ml dung dịch đệm sodium phosphate 0.03M, pH 7.2 Khi enzyme đã hòa tan hoàn toàn chi cho hỗn hợp enzyme từ từ vào cột. Cho dung môi phân ly enzyme qua cột và điều chỉnh tốc độ chảy khoảng 2ml/7phút . Loại bỏ 5ml đầu tiên rồi mới bắt đầu thu dịch enzyme. Dịch enzyme thu được đến khi dùng Ba(NO3)2 để thử ( NH4)2SO4 và thấy có xuất hiện kết tủa trắng thì ngừng quá trình thu dịch enzyme . Dịch enzyme thu nhận được làm đông khô. Quá trình lọc enzyme qua saphadex G-50 nên được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp có khả năng giảm thiểu sự biến tính của enzyme. Quá trình lọc enzyme qua saphedex diễn ra trong khoảng thời gian 1h.
• Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex G-100
Saphadex G-100 được đun cách thủy ở 100oc trong 5 giờ, sau đó ngồi vào cột kích thước 28 x 1cm. Thực hiện nhồi cột tương tự như saphedex G-50. Sau khi hoàn tất việc nhồi cột, cho dung dịch đệm sodium phosphate 0.03M, pH 7.2 chảy qua cột khoảng 3-4 giờ để cân bằng cột.
Cân 100g enzyme thô hòa vào 1ml dung dịch đệm như trên rồi cho vào cột. Chỉnh cho tốc độ của dung môi phân ly enzyme là 1ml/5 phút. Thu từng phân đoạn enzyme (mỗi phân đoạn là 3ml) và đo OD ở bước sóng 280nm. Tính trọng lượng phân tử của bromelin theo công thức:
LgM = 5,941 – 0.847 ( Ve/Vo) Trong đó : Vo = 40% Vt (Vt : thể tích tổng cộng của cột)
Ve: thể tích dung môi phân ly enzyme được tính từ lúc cho mẫu vào đến khi thu nhận mẫu.
Tinh sạch bromelin bằng phương pháp sắc kí
Bromelin thân được cho chạy sắc kí tên Doilite Cs101 ở pH 6.05 cho 2 phân đoạn khác nhau về điện tích với hoạt tình xúc tác phân giải BAEE, casein và glucagon. Sắc kí bromelin thân trên Bio Rex ở pH 6.1 sẽ thu được 5 phân đoạn khác nhau về thành phần amino axit. Khi sắc kí trên saphadex G-75 ở pH 7 cũng nhận được 5 thành phần có hoạt tính enzyme. Trọng lượng phân tử của 5 thành phần này ở trong khoảng từ 17800đến 20000 Dalton.
Bromelin thân và bromelin quả thô được cho chạy sắc kí gel trên saphadex G-75, tiếp theo sử dụng phương pháp sắc kí trao đổi trên sulfo ehtyl saphadex chỉ cho 1 phân đoạn protein đơn có hoạt tính phân giải protein này có tốc độ di chuyển khác nhau khi điện di trên polyacrylamide ở pH 9.5.
Bromelin thân: khi dùng sắc khí gel trên saphadex G-50 và sắc kí trao đổi ion trên DEAE-cellulose thì thấy có 1 thành phần chính và 5 thành phần phụ.
Bromelin thân: khi sắc kí trên DEAE-cellolose và sulfo ethyl saphadex thì thấy có 1 thành phần chính và 2 thành phần phụ.
4.4. Ứng dụng của bromelain
Trong công nghiệp thực phẩm
Được dùng làm mềm thịt khi chế biến thức ăn, hay khi làm những bộ xương khô của các loài chim thú.
Làm mềm thịt dăm bông, chế biến xúc xích, thu hồi những chế phẩm của thịt hay cá.
Được dùng thúc đẩy thủy phân đạm trong sản xuất nước chấm, sản xuất bột cá… Dùng bromelain thủy phân cá phế liệu dùng làm thức ăn cho người tạo ra các dịch thủy phân có acid amin, peptide có giá trị dinh đưỡng dùng để thay thế cho protein sữa. Ngoài ra bromelain còn làm đông sữa.
Thu nhận các chất ức chế protease
Bromelain còn được dùng trong sản xuất rượu, bia để loại protine vẫn đục. Trong y dược học
Chế tạo thành công 1 số sản phẩm có thể bổ sung cho sự thiếu protease tiêu hóa tự nhiên.
Bromelain còn ứng dụng trong giải phẫu nhằm ức chế quá trình viêm, làm giảm sưng phù, tụ huyết... trong giải phẫu thẩm mỹ người ta thường uống bromelain trước khi mổ, bromelain làm giảm khả năng khỏi bệnh từ 1-3 tuần chỉ còn lại 3-8 ngày.
Bromelain bôi lên vết thương hoặc vết bỏng làm tiêu các tổ chức chết, mau lành sẹo.
Bromelain có nhiều trong chế phẩm thuốc trị bệnh và bổ dưỡng: được dùng làm thuốc điều trị bệnh phổi, phong thấp viêm gan, rối loạn tiêu hóa, phối hợp làm tăng tác dụng của 1 số thuốc như kháng sinh, thuốc chống hen, thuốc an thần. Bromelain còn được sử dụng để thủy phân gan bò làm cao gan.
Miễn dịch học dùng bromelain để khám phá anti A, anti B trong nhóm máu người cha nhóm máu O và những người con thuộc nhóm máu A và B.
5. GIỚI THIỆU ENZYME FICIN VÀ CÁCH THU NHẬN TỪ SUNG5.1. Đặc điểm enzyme ficin 5.1. Đặc điểm enzyme ficin
Ficin (ficain) là 1 protease được tìm thấy trong nhựa cảu họ Ficus (sung, vải), thuộc họ Moraceae, bộ Urticales.
Cây sung xuất xứ vùng Tây Á và phân bố khắp vùng Địa Trung Hải, Có ít nhất khoảng 600 loài sung phân bố ở các vùng nhiệt đới và ôn đới.
Ở Việt Nam có nhiều loài sung khác nhau: sung (Ficus racemosa L), sung trổ (Ficus variegata), sung ba thùy (Ficus Hirta), sung thằn lằn (Ficus pumila L), vả (Ficus auriculata).
5.1.1. Lịch sử nghiên cứu
Cách dây hàng chục thế kỉ, co người đã biết sử dụng nhựa của các cây họ sung để làm đông tụ sữa và phomai.
Ở Trung và Nam Mỹ nhựa cảu loài sung Ficus glabrata và Ficus laurifolia được dùng như 1 loại thuốc để trị các bệnh gây ra bởi kí sinh trùng đường ruột.
Năm 1930, B.H.Robbin nhận thấy trong nhựa của cây thuộc họ sung có 1 loại enzyme có khả năng tiêu diệt được giun tròn Ascaris . Ông đặt tên cho enzyme này là ficin. Năm 1943, Caldwel thấy nhựa này cũng có thể tiêu diệt được các loài sán dây
Trichuris trichura. Năm 1939, Walti là người đầu tiên thu nhận được enzyme ficin nhựa cây thuộc họ sung.
5.1.2. Đặc điểm nguồn thu nhận ficin
Trong các cây thuộc nhóm sung, vải có vài loài có giá trị kinh tế rất lớn, mà cần kể đến cây sung ngọt (Ficus carica) vì đây là loại cây ăn quả quan trọng ở 1 số nước như Hoa Kì, Tây Ban Nha, Ý, Thổ Nhĩ Kì... sản lượng hàng năm lên đến 1 triệu tấn. Ở Việt Nam, loài sung này mới được trồng thử nghiệm bước đầu có kết quả tốt.
Cây sung ngọt có kích thước vừa hoặc nhỏ, cây sung cao từ 3-9m. Đường kính thân chính thường nhỏ hơn 17.5cm, cành nhánh phát triển mạnh. Cây có nhiều nhựa màu trắng đục có thể gây kích ứng da .Lá đơn , màu xanh sáng, mọc xen, phiến lá dài, rộng, khá dày, mặt trên lá nhám, mặt dưới có lông mịn. Phiến lá xẻ thùy chân vịt sâu , có 3-7 thùy chính và các thùy phụ cạn , có răng cưa ko đều ở mép lá. Hoa nhỏ, quả do cuống phù ra tạo thành. Quả dài từ 2-5cm, màu sắc thay đồi từ vàng xanh đến đỏ đồng hay đỏ tía sậm . Hạt có thể to, vùa hay nhỏ, có khoảng 30-1600 hạt trong 1 trái. Theo tài liệu cảu phân khoa Nông Nghiệp Mỹ ở Washington D.C, thành phần các chất trong 100g trái như sau:
Bảng 5.1: Thành phần các chất trong 100g trái sung
Thành phần Quả tươi Quả khô Thành phần Quả tươi Quả khô
Năng lượng 80 calo 274 calo Potassium 194mg 640mg
Độ ẩm 77.5-86.8 g 23g Carotene 0.013- 0.195mg --- Protein 1.2-1.3g 4.3g Thiamine 0.034- 0.06mg 0.1mg Lipid 0.14-0.3g 1.3g Riboflavin 0.053- 0.079mg 0.1mg Carbonhydra t 17.1-20.3g 69.1g Niacin 0.32- 0.412mg 0.7mg Chất xơ 1.2-2.2g 5.6g Acsorbic axit 12.2-
17.6mg
0 Tro 0.48-0.85g 2.3g Citric axit 0.1-0.44mg 0 Calcium 35-78.2mg 126mg Chất tương tự
vitamin A
Phosphorus 22-32.9mg 77mg Malic axit Vết Vết
Sắt 0.6-4.09mg 3mg Boric axit Vết Vết
Sodium 2.0mg 34mg Axallic axit Vết Vết
Hầu hết các bộ phận cảu cây có chứa nhựa bao gồm cao su 2.4% , resin, albumin, cerin, đường, malic axit, rennin, protease, diatase, esterase, lipase, catalase và perosidase. Người ta nhận thấy rằng hoạt tính enzyme ficin hki nhựa được thu nhận vào buổi sáng sớm do đó nhựa sung được thu vào sáng sớm, sấy khô để dùng trong công nghiệp thực phẩm.
5.2. Thành phần tính chất của enzyme ficin 5.2.1. Cấu tạo hóa học
Ficin là 1 loại protease thực vật trong cấu trúc bậc 1 có chứa nhóm sulfhydryl (SH). Trình tự các amino axit ở gần trung tâm phản ứng gần giống với papain và bromelin .Trình tự các amino axit ở gần trung tâm phản ứng của fici như sau:
Pro-Leu-Arg-Gln-Gly-Cys-Gly-Ser-Cys-Tryp
Tùy theo nguồn thu nhận enzyme ficin từ các loài sang khác nhau, tiến trình xác định khác nhau mà thành phần hóa học của enzyme ficin khác nhau.
Bảng 5.2: Thành phần amino axit của phân tử enzyme ficin
STT Amino axit Tên tác giả nghiên cứu
Marini bettolo
Metrione Gould Englund
1 Lysine 7 9 9 5 2 Histidine 2 2 2 1 3 Amonia --- ---- 52 25 4 Arginine 8 7 10 10 5 Aspartic axit 20 21 21 17 6 Threonine 10 8 10 8 7 Serine 13 10 16 14 8 Glutamic axit 22 23 25 25 9 Proline 11 12 13 11 10 Glycine 28 30 32 28 11 Alanine 19 21 21 20 12 Half-cystine 7 4 9 8 13 Valine 15 15 19 18 14 Methionine 3 3 4 5
15 Isoleucine 7 10 10 7 16 Leucine 14 17 17 15 17 Tyronine 11 14 15 15 18 Phenylalanine 6 5 6 5 19 Tryrtophan 3 --- 9 6 Tổng số gốc amino axit* 206 211 300 243
Với: * số lượng các gốc amino axit trên 1 mol protein
5.2.2. Tính chất vật lí
Tùy theo nguồn thu nhận enzyme ficin là các tính chất vật lí củ chúng ko giống nhau. Tuy nhiên sự khác nhau này ko lớn lắm. Một số tính chất vật lí cảu ficin có thể được trình bày như sau:
Trọng lượng phân tử: 23000-27000
Nhiệt độ hoạt động : 30-80oC, nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính xúc tác: 50-65oC Hệ số sa lắng: 2.5-2.7S
Điểm đẳng điện: 9-10
Không tan trong hầu hết dung môi hữu cơ nhưng tan 1 phần trong nước và glycerine
Tính chất vật lí của ficin ở các nguồn thu nhận khác nhau được trình bày ở bảng sau: Bảng 5.3: Tính chất vật lí của ficin Nguồn thu nhận Phương pháp tinh sạch Hệ số sa lắng Trọng lượng phân tử Điểm đẳng điện Hệ số tinh sạch A280 , A260 Hệ số tắt Bước sóng hấp thu λc ( nm ) Tác giả F.glabrata Tủa muối sắc kí trên CM- celluse, pH 7 25500 ± 750 23800 ± 700 1.95 21.1 267 Englund
F.glabata Tủa muối 2.56 26000 Bernhard và Gufreund Liener F.glabata Tủa muối sắc kí trên CM- cellulose, pH 4.4 2.61S F.carica var Kadota Các hợp phần có hoạt tính được tách từ nhựa sung bằng phương pháp sắc kí CM- cellulose, pH 7 >9.6 1.88 20.2 Kramer và Whitaker F.anthelmitica Tủa muối 26500 Marini Bettolo 5.2.3. Tính chất hóa học
pH hoạt động của ficin rộng : 4-9.5 (dịch nhựa sung có pH 5), pH tối thích của ficin phụ thuộc vào loại cơ chất enzyme: gelatin :pHopt =5 , caseinopt = 9.5, hemoglobin: pHopt = 7.
Đối với các cơ chất nhân tạo như benzyoly-arginine ehtyl ester, benzoyl-L- argininamide, hippurylamide và hippuryl methylester thì pHopt = 6.5.
Ở dạng nhựa tươi, ficin dễ bị oxi hóa bởi ko khí làm cho dịch nhựa chuyển sang màu hồng nâu hoặc hồng và đồng thời hoạt tính xúc tác bị giảm xuống.
5.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hoạt động của ficin
Các yếu tố hoạt hóa
Khi có mặt của kim loại kiềm, hoạt tính thủy giải protein của ficin tăng lên. Hoạt tính của ficin sẽ tăng lên khi nó kết hợp với 1 trong những nhân tố khử sau: cyanide, cysteine, 1,2-dimercaptopropanol hoặc mercaptoethanol.
Cysteine hoặc 1,2-dimercaptopropanol nồng độ 0.005-0.05M có thể làm tăng hoạt tính của ficin ở dạng tinh thể và HCN 0.075M làm tăng hoạt tính của ficin cao nhất so với các tác nhân hoạt hóa khác. Mặt khác, hoạt tính của ficin còn tăng hơn khi khi phối hợp giữa HCN với cysteine (cao hơn cả khi sử dụng HCN riêng lẻ).
Các yếu tố kìm hãm
Cũng như các loại enzyme thủy giải protein khác, nhóm –SH tham gia trực tiếp vào các hoạt động xúc tác của ficin . Khi các chất ức chế như HgCl2, N-ethylmalenide , iodo acetic axit, chloroqcetamide hay iodacetamide kết hợp với trung tâm hoạt động của ficin thì enzyme bị bất hoạt.
Các chất kìm hãm hoạt động của các protease động vật thì liên kết với gốc cystine của enzyme ficin cũng có thể làm bất hoạt ficin như : những dẫn xuất chloromethyl ceton của N-tosy-L-phenylalanine và N-tosyl-L-lysine, diisopropylphosphoflouridae ( DFP ), 1,3-dibromacetone cũng gây ra sự bất hoạt ficin. Trong lòng trắng trứng có 1 loại protein có khả năng kìm hãm hoạt động của ficin. Người ta cho răng khi protein này kết hợp sẽ tạo ra 1 hợp chất có hoạt tính kìm hãm enzyme.
Tính chuyên biệt
Có nhiều liên kết peptide của nhiều loại protein tự nhiên như protein sữa, hemoglobin, prtein đậu nành, gelatin, collagen, elastin, fibrin, firinogen và cả ascaris sống đều có thể bị thủy phân giải bởi enzyme ficin.
Ficin còn có thể thủy phân giải các liên kết peptide, ester, các liên kết amide của cơ chất nhân tạo.
Tính bền vững
Bền vững với nhiệt độ: khi khảo sát tính bền vững của enzyme ficin dạng tinh thể, Cogen nhận thấy chúng có thể giữ nguyên hoạt tính trong 2 giờ ở 50oC.
Dịch enzyme ficin bị mất hoạt tính qua thời gian bảo quản đông lạnh kéo dài mà nguyên nhân có thể do từng phần của enzyme bị chuyển về dạng bất hoạt do hiện tượng oxi hóa.
Bền vững với pH: trong 1 vùng pH khá rộng (4.5-9.5) độ bền vũng cảu enzyme ficin đạt đến mức cực đại nhưng trong 1 vùng pH hẹp dao động quanh pH 8 thì nó lại có tính bền vững ở mức tối thiểu. Nguyên nhân là do 1 nhóm –SH tối cần thiết bị oxi hóa. Tuy nhiên sự suy giảm tính bền vững ở pH này sẽ mất đi khi gia tăng nồng độ cysteine từ 0.01-0.025M, ficin có độ bền vững cực đại ở pH 7.5, và pHopt trung bình ở khoảng 6-7.5.
Khi hòa tan các kết tủa enzyme (sau khi tủa bằng muối) vào trong nước hay trong các dung dịch muối dễ bay hơi có thể gây ra sự bất hoạt enzyme. Do đó để tránh được hiện tượng này người ta thường hòa tan kết tủa enzyme vào dung dịch đệm phosphate 0.01M, pH 7 có NaCl 0.1M và việc gắn enzyme kên các nhân tố mang như Blue axit 83 (BB), Red axit 17(BR), Brilliant Blue R, bordeaux, Jurga’s red… Để làm tăng tính bần vững của enzyme.
Cơ chế xúc tác của enzyme: các loại enzyme protease thu từ đu đủ, sung, vải, dứa, có tên gọi là thio-protease, cysteineprotease hay sulfhydryl-protease có khả năng bền với nhiệt trong khoảng 60-80oC ở pH tự nhiên. Tâm hoạt động của các enzyme này