4. GIỚI THIỆU ENZYME BROMELIN VÀ CÁCH THU NHẬN TỪ DỨA
4.2.2. Cấu trúc không gian của bromelin
Murachi và busan phân tích cấu trúc bậc 1 của bromelin và nhận thấy cách sắp xếp trong phân tử bromelin như sau:
Bromelin là 1 protease trong tâm hoạt động có chứa cysteine và 2 sợi polypeptide liên kết với nhau bằng –S-S-. Phân tử có dang hình cầu do có cách sắp xếp phức tạp.
Trong phân tử bromelin thân có chứa nhóm sulfhydryl có vai trò chủ yếu trong hoạt tình xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite. Ngoài ra, trong phân tử còn có các ion Zn2+ có lẽ có vai trò trong duy trì cấu trúc ko gian của enzyme.
4.2.3. Tính chất vật lí
Các nghiên cứu về tính chất vật lí của bromelin thân dứa được Murachi và công sự nghiên cứu và công bố vào năm 1964 như sau :
Bảng 4.2: Những tính chất vật lí của bromelin thân
Hằng số sa lắng S 2.73S
Hằng số khếnh tán D 7.77 x 10-7 cm2/s
Thể tích riêng phần V 0.743 ml/g
Độ nhớt bên trong [I] 0.039 dl/g
Tỉ số ma sát f/fo 1.26
Điểm đảng điện Pl 9.55
Sự hấp thu A1%
cm ở 280 nm 20.1
Trong lượng phân tử --- 33.200*
32.100** 35.500*** Với *: tính bằng phương pháp sa lắng – khếnh tán
***: tính bằng phương pháp Archibald
4.2.4. Hoạt tính của bromeline
Hoạt tính phân giải của bromelin
Bromelin có hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase và esterase. Bromelin thân có nhiều cớ chất tự nhiên và có thể thủy phân cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp. Khả năng phân giải các cơ chất tự nhiên của bromelin.
Bảng 4.3: Hoạt tính phân giải casein của bromelin Cơ chất
Hoạt tính phân giải casein (UI/mg) Bromelin thân Bromelin quả
xanh
Bromelin quả chín
Casein 7.4 4.0 3.0
Đối với cơ chất là casein, hoạt tính phân giải của bromelin thân cao hơn bromelin quả xanh và bromelin quả chín. Khả năng phân giải các cơ chất nhân tạo cảu bromelin.
Bảng 4.4: Hoạt tính phân giải Benzoyl-L-Arginine amide amide ( BAA) của bromelin
Cơ chất
Hoạt tính phân giải (UI/mg) Bromeline thân Bromeline quả
xanh
Bromeline quả chín
BAA 3.7 9.1 7.2
Bảng 4.5: Hằng số Miachaelis với các cơ chất tổng hợp khác nhau*
Bromeline thân
BAA BAEE BAEM
3.2 x 10-2 1.7 x 10-1 3.2 x 10-2
Với: * ở điều kiện nhiệt độ 50 C và pH 6.0; BAA : benzoyl-L-Arginine amide BAEE : benzoyl-L-Arginine ethyl ester , BAEM : benzoyl-L-Arginine methyl ester
Bromelin quả xanh có hoạt tính phân giải BAA cao hơn bromelin thân và bromeline quả chín.
So với BAA , hằng số xúc tác cảu bromelin thân trên BAEE cao hơn gấp 140 lần. Sự khác biệt này có lẽ do cơ chế xúc tác khác nhau.
Giống như các cấu trúc sinh học khác, bromelin chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố như cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH , ion kim loại, 1 số nhóm chức, phương pháp trích ly…
Các yếu tố như nhiệt độ, pH thích hợp cho hoạt động của các phản ứng xúc tác của bromelin ko ổ định mà phụ thuộc lẫn nhau và phụ thuộc các yếu tố khác như bản chất cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, thời gian phản ứng…
Ảnh hưởng bởi cơ chất: trên những loại cơ chất khác nhau, bromelin có hoạt tính khác nhau. Nếu cơ chất là hemoglobin thì khả năng phân giải cảu bromelin mạnh hơn papain 4 lần. Đối với cơ chất tổng hợp như BAA ( benzoyl-L-Arginine amide), BAEE (benzoyl-L-Arginine ethyl ester) thì khả năng thủy giải cảu bromelin yếu hơn papain .
Ảnh hưởng bởi nhiệt độ: nhiệt độ cảu phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố: thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ có những thay đổi làm ảnh hưởng đến hoạt tình enzyme, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại cảu enzyme.
Ở dịch quả chiết (pH 3.5) khi tăng nhiệt độ lên đến 60oC thì bromelin vẫn còn hoạt tính nhưng bromelin tinh khiết nhạy cảm với nhiệt độ. Ở 5oC, ph 5-10 thì enzyme giữ hoạt tính tối đa trên casein trong vòng 24 giờ. Ở 55oC, pH 6.1 thì enzyme bị mất 50% hoạt tính trong vòng 20 phút. Quá trình đông khô làm mất 27% hoạt tính.
Ảnh hưởng của độ pH: pH là yếu tố quan trong nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác cảu enzyme. pH tối thích của bromelin ko ổn định mà tùy thuộc vào nhiệt độ thời gian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch của enzyme, bản chất cảu dung dịch đệm, sự hiện diện của chất tăng hoạt.
Khi thu nhận bromelin thân, nếu dùng tác nhân kết tủa là ammonium sulfate hoặc molypdeum carbonate thì enzyme có hoạt tính cao nhất ở pH 4.8 và ổn định ở pH 4.6-5.4. Bromelin thân đã được tinh sạch 1 phần có hoạt tính cao nhất ở pH 6.0 và pH 8.0 ổn định ở pH 3.5-4.6 với nhiệt độ 63oC. Enzyme bromelin đã tinh sạch chỉ còn lại 60-70% hoạt tính. Bromelin có biên độ pH rộng (3-10) nhưng pH tối thích của enzyme là 5-8 tùy thuộc vào cơ chất.
Ảnh hưởng bởi các ion kim loại: các ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme do chúng thường gắn vào các trung tâm hoạt động của enzyme. Muối thủy
phân có ảnh hưởng quan trọng đến hoạt tính enzyme bromelin và mức độ kìm hãm thay đổi theo nồng độ của muối.
Ngoài ra, còn ảnh hưởng những chất có tác động ức chế bromelin do chúng kết hợp với nhóm SH của trung tâm phản ứng của enzyme.
Bảng 4.6: Ảnh hưởng bởi trạng thái và điều kiện bảo quản trên hoạt tính của bromelin
Hoạt tính ( UI/mg protein )
Dịch chiết Đông khô
Nguyên liệu tươi 1.600 1.150
Bảo quản ở 4oC trong 5 ngày
830 630
Sấy khô ở 4oC 1.880 1.360
4.3. Phương pháp thu nhận và tinh sạch bromelin 4.3.1. Phương pháp thu nhận 4.3.1. Phương pháp thu nhận
Enzyme bromelin có thể thu được trong thân, trong phần thịt quả và trong chồi quả. Việc thu nhận và tinh sạch bromelin có thể thực hiện theo sơ đồ sau:
Quả dứa hoặc thân được xay nhuyễn, vắt kĩ, lọc bỏ bã và thu dịch lọc, ly tâm dịch lọc với tốc độ 6000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ chất xơ sẽ thu được dịch chiết chứa bromelin.
Tuy nhiên, khi sử dụng phương pháp siêu lọc để tinh sạch enzyme bromelin thì các hợp chất pectin ở trong dịch chiết quả sẽ làm tăng độ nhớt của dịch chiết sẽ lảm trở ngại cho quá trình lọc. Các nhà khoa học S.Sathivel, K.Niranjan và W.prinyakiwatkul đã tìm ra phương pháp đồng hóa nguyên liệu dưới điều kiện áp suất cao thì có thể phá vỡ tế bào mô dứa, giảm độ nhớt của dịch chiết, phóng thích các enzyme nội bào mà ko cần làm biến tính chúng.
Theo nghiên cứu này thì khả năng đồng hóa nguyên liệu ở 15Mpa độ nhớt trong dịch chiết giảm xuống, giá trị của độ Bx và pH thay đổi ko đáng kể, sản lượng và hoạt tín cảu enzyme gia tăng. Ở 15Mpa, sản lượng enzyme tăng gấp 2 lần (1.27g/500ml dịch chiết từ quả kể cả phần lõi) với hoạt tính cao nhất là 2.06 UI/mgso với khi đồng hóa ở điều kiện thường và ở 20Mpa thì sản lượng enzyme thu được từ vỏ quả là 0.9g/500ml dịch chiết. Vậy đồng hóa mẫu dưới áp suất cao có thể làm giảm độ nhớt của dịch chiết giúp cho việc sử dụng phương pháp siêu lọc thuận lợi hơn, đồng thời làm tăng sản lượng và hoạt tính của enzyme bromelin từ qua dứa và các phế phẩm của nó.
Các phương pháp tách bromelin
• Phương pháp kết tủa enzyme
Nguyên tắc: điểm đảng điện của đa số protein thấp hơn pH 7 do đó trong điều kiện sinh lí, các phân tử protein có tích điện âm thừa và chính những điện tích âm thừa này đã kết hợp với đầu mang điện tích dương của phân tử nước hữu cực (ở trong dung dịch, protein liên kết với 1 lượng nước khá lớn) cũng như các ion dương. Sự kết hợp với nước tạo ra 1 lớp nước bao xung quanh phân tử protein và cản trở sự kết tủa của chúng. Đối với enzyme protein cũng như các enzyme protein khác, để có thể kết tủa được enzyme, điều cần thiết là phải phá vỡ lớp nước liên kết xung quang phân từ này bằng cách bổ sung vào dung dịch protein enzyme các dung môi hoặ các hóa chất ưa nước có ái lực với nước mạnh hơn protein để lôi kéo nước ra khỏi phân tử protein đó, giúp cho protein tủa xuống.
Các dung môi thường sử dụng dể kết tủa bromelin là acetone và ethanol, còn các hóa chất khác như muối trung tính ở nồng độ cao cũng có thể kết tủa được enzyme. Ammonium sulfate là loại muối trung tính có độ hòa tan rất tốt do đó ở dung dịch bão hòa cảu muối này thì tất cả protein đều kết tủa.
Heinicker và Gortner đã dùng acetone để kết tủa bromelin từ thân và trái. Bromelin trong dung dịch nước rất nhạy cảm với các dung môi hữu cơ do đó để sự kết tủa đạt hiệu quả cao thượng tiến hành kết tủa trong điều kiện lạnh. Như vậy nước ép từ thân và trái dứa phải được làm lạnh ở 0-4oC và acetone tinh khiết ở 20oC. Ethanol cũng phải được sử dụng để kết tủa protein và hỗn hợp bromelin-ethanol cũng phải giữ ở điều kiện nhiệt độ lạnh. Sau khi thu được kết tủa, tủa protein phải được rửa bằng acetone và làm khô thật nhanh để bromelin ko bị biến tính.
Renee Tisseau đã sử dụng ammonium sulfate với nồng độ bão hòa là 0.7 (70% bão hòa) để làm tác nhân kết tủa bromelin. Sự kết hợp với tác nhân ammonium sulfate (đặc biệt ở nhiệt thấp) là 1 quá trình thuận nghịch, tủa dễ dàng hòa tan bằng nước và muối có thể được loại bỏ ra khỏi protein bằng cách thẩm tích. Phương pháp này có thể thực hiện ở nhiệt độ thường.
Để thu nhận enzyme, việc đầu tiên là phải phá vỡ tổ chức mô có chứa enzyme bằng cách nghiền các mô để thu dịch chiết cò chứa bromelin rồi sau đó dùng tác nhân khác nhau để kết tủa bromelin.
Những yếu tố chính ảnh hưởng đến hiệu suất chất lượng của chế phẩm enzyme là:
- Nồng độ ammonium sulfate - pH của dịch chiết
- Nhiệt độ kết tủa
- Thời gian tiếp xúc của tác nhân đệm và dịch chiết
Thông thường nếu sử dụng phương pháp kết tủa với ammonium sulfate thì cứ 60 kg nguyên liệu tươi sẽ thu được khoảng 1 kg bromelin thô.
Cách làm:
- Tủa bằng muối ammonium sulfate : chuẩn bị 1 lít dung dịch nước dứa sau khi li tâm, cho từ từ 532g ammonium sulfate vào và khuấy đều (dung dịch đạt độ bão hào
ammonium sulfate là 70%). Để yên ở nhiệt độ phóng 10-15 phút sau đó li tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút để thu nhận kết tủa.
- Tủa bằng ethanol: làm lạnh dung dịch nước dứa sau khi li tâm , cho ethanol 96o (cũng đã được làm lạnh) vào theo tỉ lệ 4.1 (4 nước dứa, 1 cồn), trộn đều, để ở nhiệt độ 0oC trong 3-4 giờ. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút, rửa tủa bằng acetone và thu nhận tủa.
- Tủa bằng acetone: thêm 1 thể tích acetone lạnh hoặc 20% acetone lạnh vào 1 thể tích dung dịch nước dứa sau ly tâm . Để yên trong 1 giờ ở nhiệt độ 0oC-4oC .Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút , loại bỏ tủa . Thêm 2 thể tích acetone lạnh vào , để 1 giờ 0oC-4oc ,ly tâm thu tủa và rửa tủa bằng acetone lạnh .
• Phương pháp hấp thụ
Có nhiều chất được sử dụng làm chất hấp thụ enzyme. Có thể sử sụng kaolin hay betonite để hấp thụ bromelin. Trình tự thực hiện tương tự như nhau.
Cấu tạo của kaolin: kaolin là 1 loại khoáng vật sét có khả năng hấp thụ tốt . Kaolin có cấu tạo thành từng lớp , mỗi lớp có 1 tấm tứ diện SiO44- và 1 tấm bát diên Al(OH)63-, đỉnh chung của tấm tứ diện quay về phía tấm bát diên. Ở ngay vị trí chung này thì các ion OH- của tấm bát diện được thay thế bằng ion O2- của tấm tứ diện .
Ở vị trí của 2 lớp sát cạnh nhau, các ion O2- ở bề mặt của lớp này mằn gần giữa các ion OH- ỏ bề mặt của lớp kia và do đó xuất hiện liên kết hydrogen giữa các ion trái dấu này lam cho các lớp kaolin dính sát lại gần nhau và khoảng cách giữa 2 lớp là 7.1 Ao.
Kaolon có cấu tạo thành từng lớp và có độ phân tán cao, do đó chúng có tính dẻo đặc biệt và có khả năng tạo thành kết dính. Một tính chất quan trong là do kaolin có độ phân tán cao nên nó có ảnh hưởng đến hấp phụ các chất.
Kaolin là 1 chất có tính hấp phụ tốt . Kích thước hạt nhỏ hơn 1µm do đó diện tích tiếp xúc giữa hạt kaolin và chất bị hấp phụ tăng lên rất nhiều. Một lí do khác dẫn đến khả năng hấp phụ vật chất cảu kaolin cao , là do bề mặt kaolin co rất nhiều ion OH- và O2- , những ion này có khả liên kết tương đối bền vững với các chất bị hấp phụ.
Cách làm: cho kaolin khô (hoặc đã ngâm cho trương nở) vào dung dịch nước dứa sau khi li tâm với tỉ lệ 25mg kaolin/ml dung dịch nước dứa. Khấy đều bằng máy khuấy từ, sau đó ly tâm để thu tủa. Tủa được gọi là bromelin-kaolin.
• Phương pháp siêu lọc
Siêu lọc là quá trình chảy qua 1 màng lọc dưới 1 áp suất để tách phân đoạn các thành phần trong chất lỏng đó. Sự phân chia các phân đoạn phụ thuộc vào kích thước lỗ tren màng và tùy theo trọng lượng phân tử của chất thấm qua. Tùy theo kích thước của lỗ trên màng (giá trị loại từ cut-off) mà sau khi thực hiện quá trình siêu lọc sẽ thu được nước và các chất có phân tử nhỏ còn những chất có phân tử lớn sẽ bị giữ lại trên màng.
Dung dịch enzyme sau khi thu được từ nguyên liệu thực vật sẽ có chứa những tạp chất có trọng lượng phân tử khác nhau. Đầu tiên sử dụng phương pháp lọc để loại trừ các chất bển. Sau đó chyển sang dùng phương pháp siêu lco5 thì sẽ loại được các chất có trọng lượng phân tử thấp hơn các protein enzyme và đồng thời cô đặc được enzyme.
Phương pháp siêu lọc được sử dụng trong ngành công nghệ thực phẩm và các quá trình sản xuất sinh học để tách các chất dễ bị biến tính bởi nhiệt như lọc và ổn định rượu vang , lọc nươc ép trái cây , cô đặc sữa làm phô mai, làm bơ, cô đặc lòng trắng trứng , cô đặc huyết thanh động vật và tinh sạch các chất pectin, gum, gelatin… cô đặc và tinh sạch các enzyme, kháng thể, polysaccharide, polipeptide, vaccine… thu hồi các protein và các cacbonhydrat từ nước thải và các sản phẩm phụ .
Màng siêu lọc: màng siêu lọc được cấu tạo bởi các sợi giống. Trong mỗi sợi giống lại có nhiều sợi giống xếp song song và gắn chặt với lớp ngoài tạo thành các lỗ để các chất thấm qua. Các sợi này được chế tạo từ polime bền như fluoro polimer ( FS), cellulose acetate (CA), polysulphone (GR)… Tùy theo mục đích cụ thể mà người ta sử dụng loại màng thích hợp. Ví dụ cô đặc protein: dùng màng FS, GR, cô đặc enzyme dùng màng GR.
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình siêu lọc: trong quá trình siêu lọc cần chú ý đến các yếu tố sau:
- Nhiệt độ: nhiệt độ phải thích hợp với sản phẩm và loại màng sử dụng. Khi chọn nhiệt độ cần lưu ý đến khả năng kết tủa của protein và sự tăng nhiệt độ trong quá trình siêu lọc vì các yếu tố này có thể làm bít màng.
- Áp suất: thường tốc độ của dỏng chảy (số lít chất lỏng chảy qua 1m2 màng trong 1 giờ) sẽ tăng cùng với sự gia tăng áp suất cho đến khi đạt giá trị tốc độ cực đại. Nếu áp suất tăng cao hơn thì tốc độ dòng chảy sẽ giảm. Người ta đề nghị tốc độ dòng chảy nên được chỉnh từ 4-5 lít/phút, tương ưng với hiệu số PI1 – PI2 ở trong khoảng 0.5- 3bar. Áp suất dòng vào lớn nhất (PI1 max) là 7bar (tương ứng 102Psi), áp suất dòng ra