5. GIỚI THIỆU ENZYME FICIN VÀ CÁCH THU NHẬN TỪ SUNG
5.1.1. Lịch sử nghiên cứu
Cách dây hàng chục thế kỉ, co người đã biết sử dụng nhựa của các cây họ sung để làm đông tụ sữa và phomai.
Ở Trung và Nam Mỹ nhựa cảu loài sung Ficus glabrata và Ficus laurifolia được dùng như 1 loại thuốc để trị các bệnh gây ra bởi kí sinh trùng đường ruột.
Năm 1930, B.H.Robbin nhận thấy trong nhựa của cây thuộc họ sung có 1 loại enzyme có khả năng tiêu diệt được giun tròn Ascaris . Ông đặt tên cho enzyme này là ficin. Năm 1943, Caldwel thấy nhựa này cũng có thể tiêu diệt được các loài sán dây
Trichuris trichura. Năm 1939, Walti là người đầu tiên thu nhận được enzyme ficin nhựa cây thuộc họ sung.
5.1.2. Đặc điểm nguồn thu nhận ficin
Trong các cây thuộc nhóm sung, vải có vài loài có giá trị kinh tế rất lớn, mà cần kể đến cây sung ngọt (Ficus carica) vì đây là loại cây ăn quả quan trọng ở 1 số nước như Hoa Kì, Tây Ban Nha, Ý, Thổ Nhĩ Kì... sản lượng hàng năm lên đến 1 triệu tấn. Ở Việt Nam, loài sung này mới được trồng thử nghiệm bước đầu có kết quả tốt.
Cây sung ngọt có kích thước vừa hoặc nhỏ, cây sung cao từ 3-9m. Đường kính thân chính thường nhỏ hơn 17.5cm, cành nhánh phát triển mạnh. Cây có nhiều nhựa màu trắng đục có thể gây kích ứng da .Lá đơn , màu xanh sáng, mọc xen, phiến lá dài, rộng, khá dày, mặt trên lá nhám, mặt dưới có lông mịn. Phiến lá xẻ thùy chân vịt sâu , có 3-7 thùy chính và các thùy phụ cạn , có răng cưa ko đều ở mép lá. Hoa nhỏ, quả do cuống phù ra tạo thành. Quả dài từ 2-5cm, màu sắc thay đồi từ vàng xanh đến đỏ đồng hay đỏ tía sậm . Hạt có thể to, vùa hay nhỏ, có khoảng 30-1600 hạt trong 1 trái. Theo tài liệu cảu phân khoa Nông Nghiệp Mỹ ở Washington D.C, thành phần các chất trong 100g trái như sau:
Bảng 5.1: Thành phần các chất trong 100g trái sung
Thành phần Quả tươi Quả khô Thành phần Quả tươi Quả khô
Năng lượng 80 calo 274 calo Potassium 194mg 640mg
Độ ẩm 77.5-86.8 g 23g Carotene 0.013- 0.195mg --- Protein 1.2-1.3g 4.3g Thiamine 0.034- 0.06mg 0.1mg Lipid 0.14-0.3g 1.3g Riboflavin 0.053- 0.079mg 0.1mg Carbonhydra t 17.1-20.3g 69.1g Niacin 0.32- 0.412mg 0.7mg Chất xơ 1.2-2.2g 5.6g Acsorbic axit 12.2-
17.6mg
0 Tro 0.48-0.85g 2.3g Citric axit 0.1-0.44mg 0 Calcium 35-78.2mg 126mg Chất tương tự
vitamin A
Phosphorus 22-32.9mg 77mg Malic axit Vết Vết
Sắt 0.6-4.09mg 3mg Boric axit Vết Vết
Sodium 2.0mg 34mg Axallic axit Vết Vết
Hầu hết các bộ phận cảu cây có chứa nhựa bao gồm cao su 2.4% , resin, albumin, cerin, đường, malic axit, rennin, protease, diatase, esterase, lipase, catalase và perosidase. Người ta nhận thấy rằng hoạt tính enzyme ficin hki nhựa được thu nhận vào buổi sáng sớm do đó nhựa sung được thu vào sáng sớm, sấy khô để dùng trong công nghiệp thực phẩm.
5.2. Thành phần tính chất của enzyme ficin 5.2.1. Cấu tạo hóa học
Ficin là 1 loại protease thực vật trong cấu trúc bậc 1 có chứa nhóm sulfhydryl (SH). Trình tự các amino axit ở gần trung tâm phản ứng gần giống với papain và bromelin .Trình tự các amino axit ở gần trung tâm phản ứng của fici như sau:
Pro-Leu-Arg-Gln-Gly-Cys-Gly-Ser-Cys-Tryp
Tùy theo nguồn thu nhận enzyme ficin từ các loài sang khác nhau, tiến trình xác định khác nhau mà thành phần hóa học của enzyme ficin khác nhau.
Bảng 5.2: Thành phần amino axit của phân tử enzyme ficin
STT Amino axit Tên tác giả nghiên cứu
Marini bettolo
Metrione Gould Englund
1 Lysine 7 9 9 5 2 Histidine 2 2 2 1 3 Amonia --- ---- 52 25 4 Arginine 8 7 10 10 5 Aspartic axit 20 21 21 17 6 Threonine 10 8 10 8 7 Serine 13 10 16 14 8 Glutamic axit 22 23 25 25 9 Proline 11 12 13 11 10 Glycine 28 30 32 28 11 Alanine 19 21 21 20 12 Half-cystine 7 4 9 8 13 Valine 15 15 19 18 14 Methionine 3 3 4 5
15 Isoleucine 7 10 10 7 16 Leucine 14 17 17 15 17 Tyronine 11 14 15 15 18 Phenylalanine 6 5 6 5 19 Tryrtophan 3 --- 9 6 Tổng số gốc amino axit* 206 211 300 243
Với: * số lượng các gốc amino axit trên 1 mol protein
5.2.2. Tính chất vật lí
Tùy theo nguồn thu nhận enzyme ficin là các tính chất vật lí củ chúng ko giống nhau. Tuy nhiên sự khác nhau này ko lớn lắm. Một số tính chất vật lí cảu ficin có thể được trình bày như sau:
Trọng lượng phân tử: 23000-27000
Nhiệt độ hoạt động : 30-80oC, nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính xúc tác: 50-65oC Hệ số sa lắng: 2.5-2.7S
Điểm đẳng điện: 9-10
Không tan trong hầu hết dung môi hữu cơ nhưng tan 1 phần trong nước và glycerine
Tính chất vật lí của ficin ở các nguồn thu nhận khác nhau được trình bày ở bảng sau: Bảng 5.3: Tính chất vật lí của ficin Nguồn thu nhận Phương pháp tinh sạch Hệ số sa lắng Trọng lượng phân tử Điểm đẳng điện Hệ số tinh sạch A280 , A260 Hệ số tắt Bước sóng hấp thu λc ( nm ) Tác giả F.glabrata Tủa muối sắc kí trên CM- celluse, pH 7 25500 ± 750 23800 ± 700 1.95 21.1 267 Englund
F.glabata Tủa muối 2.56 26000 Bernhard và Gufreund Liener F.glabata Tủa muối sắc kí trên CM- cellulose, pH 4.4 2.61S F.carica var Kadota Các hợp phần có hoạt tính được tách từ nhựa sung bằng phương pháp sắc kí CM- cellulose, pH 7 >9.6 1.88 20.2 Kramer và Whitaker F.anthelmitica Tủa muối 26500 Marini Bettolo 5.2.3. Tính chất hóa học
pH hoạt động của ficin rộng : 4-9.5 (dịch nhựa sung có pH 5), pH tối thích của ficin phụ thuộc vào loại cơ chất enzyme: gelatin :pHopt =5 , caseinopt = 9.5, hemoglobin: pHopt = 7.
Đối với các cơ chất nhân tạo như benzyoly-arginine ehtyl ester, benzoyl-L- argininamide, hippurylamide và hippuryl methylester thì pHopt = 6.5.
Ở dạng nhựa tươi, ficin dễ bị oxi hóa bởi ko khí làm cho dịch nhựa chuyển sang màu hồng nâu hoặc hồng và đồng thời hoạt tính xúc tác bị giảm xuống.
5.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hoạt động của ficin
Các yếu tố hoạt hóa
Khi có mặt của kim loại kiềm, hoạt tính thủy giải protein của ficin tăng lên. Hoạt tính của ficin sẽ tăng lên khi nó kết hợp với 1 trong những nhân tố khử sau: cyanide, cysteine, 1,2-dimercaptopropanol hoặc mercaptoethanol.
Cysteine hoặc 1,2-dimercaptopropanol nồng độ 0.005-0.05M có thể làm tăng hoạt tính của ficin ở dạng tinh thể và HCN 0.075M làm tăng hoạt tính của ficin cao nhất so với các tác nhân hoạt hóa khác. Mặt khác, hoạt tính của ficin còn tăng hơn khi khi phối hợp giữa HCN với cysteine (cao hơn cả khi sử dụng HCN riêng lẻ).
Các yếu tố kìm hãm
Cũng như các loại enzyme thủy giải protein khác, nhóm –SH tham gia trực tiếp vào các hoạt động xúc tác của ficin . Khi các chất ức chế như HgCl2, N-ethylmalenide , iodo acetic axit, chloroqcetamide hay iodacetamide kết hợp với trung tâm hoạt động của ficin thì enzyme bị bất hoạt.
Các chất kìm hãm hoạt động của các protease động vật thì liên kết với gốc cystine của enzyme ficin cũng có thể làm bất hoạt ficin như : những dẫn xuất chloromethyl ceton của N-tosy-L-phenylalanine và N-tosyl-L-lysine, diisopropylphosphoflouridae ( DFP ), 1,3-dibromacetone cũng gây ra sự bất hoạt ficin. Trong lòng trắng trứng có 1 loại protein có khả năng kìm hãm hoạt động của ficin. Người ta cho răng khi protein này kết hợp sẽ tạo ra 1 hợp chất có hoạt tính kìm hãm enzyme.
Tính chuyên biệt
Có nhiều liên kết peptide của nhiều loại protein tự nhiên như protein sữa, hemoglobin, prtein đậu nành, gelatin, collagen, elastin, fibrin, firinogen và cả ascaris sống đều có thể bị thủy phân giải bởi enzyme ficin.
Ficin còn có thể thủy phân giải các liên kết peptide, ester, các liên kết amide của cơ chất nhân tạo.
Tính bền vững
Bền vững với nhiệt độ: khi khảo sát tính bền vững của enzyme ficin dạng tinh thể, Cogen nhận thấy chúng có thể giữ nguyên hoạt tính trong 2 giờ ở 50oC.
Dịch enzyme ficin bị mất hoạt tính qua thời gian bảo quản đông lạnh kéo dài mà nguyên nhân có thể do từng phần của enzyme bị chuyển về dạng bất hoạt do hiện tượng oxi hóa.
Bền vững với pH: trong 1 vùng pH khá rộng (4.5-9.5) độ bền vũng cảu enzyme ficin đạt đến mức cực đại nhưng trong 1 vùng pH hẹp dao động quanh pH 8 thì nó lại có tính bền vững ở mức tối thiểu. Nguyên nhân là do 1 nhóm –SH tối cần thiết bị oxi hóa. Tuy nhiên sự suy giảm tính bền vững ở pH này sẽ mất đi khi gia tăng nồng độ cysteine từ 0.01-0.025M, ficin có độ bền vững cực đại ở pH 7.5, và pHopt trung bình ở khoảng 6-7.5.
Khi hòa tan các kết tủa enzyme (sau khi tủa bằng muối) vào trong nước hay trong các dung dịch muối dễ bay hơi có thể gây ra sự bất hoạt enzyme. Do đó để tránh được hiện tượng này người ta thường hòa tan kết tủa enzyme vào dung dịch đệm phosphate 0.01M, pH 7 có NaCl 0.1M và việc gắn enzyme kên các nhân tố mang như Blue axit 83 (BB), Red axit 17(BR), Brilliant Blue R, bordeaux, Jurga’s red… Để làm tăng tính bần vững của enzyme.
Cơ chế xúc tác của enzyme: các loại enzyme protease thu từ đu đủ, sung, vải, dứa, có tên gọi là thio-protease, cysteineprotease hay sulfhydryl-protease có khả năng bền với nhiệt trong khoảng 60-80oC ở pH tự nhiên. Tâm hoạt động của các enzyme này gồm có hai axit amin là cystein và histidine.
Cơ chế thủy phân giải protein xảy ra qua 2 giai đoạn: Giai đoạn 1 : giai đoạn “ acyl hóa”
Giai đoạn 2 : giai đoạn “ deacyl hóa “ có sự tham gia của phân tử nước .
5.2.5. Một số yếu tố khác ảnh hưởng lên khả năng thùy phân proteincủa ficin của ficin
Hoạt động thủy phân giải protein của enzyme ficin cịu ảnh hưởng rất nhiều bởi nhiệt độ. Trong khoảng nhiệt độ ko làm biến tính enzyme, tốc độ phản ứng của enzyme tỉ lệ thuận lợi với sự gia tăng nhiệt độ và nhiệt độ.
Mỗi enzyme có 1 nhiệt độ thích hợp nhất cho hoạt động xúc tác của nó , tại đó tốc độ phản ứng cảu enzyme đạt đến tối đa. Điểm nhiệt độ đó được gọi là nhiệt độ tối thích của hoạt động enzyme.
Độ pH
Độ pH của môi trường có ảnh hưởng lớn đến tốc độ phản ứng của enzyme. Mỗi enzyme có 1 trị số pH thích hợp nhất cho hoạt động của enzyme được gọi là pH tối thích, tại đó tốc độ phản ứng của enzyme đạt đến mức cực đại.
Độ pH ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme do: - Tác động vào trạng thái ion hóa của phân tử enzyme - Tác động vào trạng thái ion hóa của cơ chất
- Tác dụng vào độ bền của phân tử enzyme
- Tác dụng vào sự kết hợp giữa phần prtein và phi protein của phân tử enzyme.
5.3. Phương pháp thu nhận ficin
5.3.1. Phương pháp thu nhận ficin thô
Thu nhận dịch enzyme ficin từ các bộ phận của cây sung
Từ lá và quả xanh: lá và quả xanh sau khi hái về được rửa sơ, cắt nhỏ ngâm trong nước rồi xay nhuyễn. Lọc qua vải thường loại bỏ xác và thu lấy dịch lọc. Dịch lọc được xác định đem đi xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp Kunitz, từ đó xác định hoạt tính của enzyme ficin chứa trong dịch lọc.
Từ nhựa thân: nhựa sung được thu vào buổi sáng từ 6-8 giờ. Dùng dao rạch trên thân cây, cho nhựa chảy vào lọ thủy tinh có màu và đậy kín. Nhựa sung được bảo quản lạnh ở ngăn đông có nhiệt độ thấp hơn 0oC. Hoạt tính của protease trong nhựa tươi được xác định bằng phương pháp Kunitz.
5.3.2. Một số phương pháp chiết tách enzyme
Phương pháp chiết tách enzyme dựa vào tính hòa tan
Người ta có thể sử dũng nhiều chất khác nhau để tủa protein như ammonium sulfate, Pi, dung môi hữu cơ: ethanol 96% acetone.
Tủa phân đoạn enzyme băng dung môi hữu cơ (ethanol 96% acetone)
Mục đích: thu nhận enzyme hay protein từ dung dịch bằng cách sử dụng các dung môi hữu cơ.
Nguyên tắc: có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến độ hòa tan của protein trong dung môi, trong đó hằng số điện môi của dung dịch. Những dung môi có hằng số điện môi lớn như nước hay dimethylsulfoxide có thể ổ định mối tương tác giữa các phân tử của dung môi với các phân tử protein, giúp cho sự hòa tan của protein trong dung dịch. Các dung môi có hằng số điên môi nhỏ ( acetone, ethanol…) ngược lại sẽ ngăn cản sự phân tán các phân tử protein trong dung dịch. Vì vậy, khi bổ sung dung môi hữu cơ vào dung dịch enzyme sẽ làm giảm khả năng hòa tan của enzyme và dẫn đến sự kết tủa.
Ethanol 96% và acetone thường được sử dụng để kết tủa enzyme do chúng ở dạng tinh khiết , ít bị lẫn tạp chất và giá tương tối rẻ. Mặt khác các dung môi này dễ bay hơi do đó dễ dàng tách bỏ dung môi ra khỏi chế phẩm enzyme bằng cách sấy nhẹ hay bằng quạt gió.
Hóa chất:
- Dung dịch chứa enzyme cần tinh sạch - Acetone
- Ethanol 96% Cách làm:
Hút 4 ml dung dịch chứa enzyme cần tinh sạch vào ống nghiệm .
Vừa khuấy, vừa nhỏ từ từ dung môi (acetoe hay ethanol 96%) đến khi bắt đầu xuất hiện kết tủa (các hạt kết tủa bám vào thành ống nghiệm). Chú ý khuấy mạnh tay để tránh hiện tượng kết tủa cục bộ.
Để yên dung dịch sau khi tủa trong khoảng 1 thời gian 15-20 phút.
Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút. Kết tủa thu được đem hòa tan trong 4ml nước.
Dịch ly tâm sau khi đã thu kết tủa được tiếp tục thục hiện kết tủa tương tự như trên cho đến khi thu hết được enzyme trong dung dịch .
Mục đích: thu nhận proteinhay enzyme từ dung dịch bằng cách sử dụng 1 lượng thừa dung dịch muối \.
Nguyên tắc: tính hòa tan của enzyme ngoài sự phụ thuộc vào hằng số điện môi cảu dung dịch, nó còn phụ thuộc vào nồng độ muối trong dung dịch. Khi nồng độ muối trong dung dịch thấp, các phân tử muối giúp ổn định các nhóm chức năng khác nhau của phân tử protein do đó giúp cho tính hòa tan của enzyme trong dung dịch và làm tăng tính hòa tan cảu protein. Nồng độ muối tăng thì độ hòa tan cảu protein càng tăng. Tuy nhiên khi nồng độ muối tăng quá cao sẽ làm giảm độ hòa tan của enzyme và khi ko còn đủ lượng nước cần thiết để tương tác với các phân tử protein thì protein bắt đầu kết tủa.
Hóa chất:
- Dung dịch chứa enzyme cần thu - dung dịch ( NH4)2SO4 bão hòa Cách làm:
Hút 4 ml dung dịch cần kết tủa vào ống nghiệm
Vừa khuấy vừa nhỏ từng giọt dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa vào dung dịch enzyme bằng ống hut có chia độ hay ống chuẩn độ cho đến khi bắt đầu xuất hiện kết tủa (các hạt kết tủa bám vào thành ống nghiệm) để quá trình kết tủa protein đạt đến sự ổn định cần để yên dung dịch sau khi tủa 1 khoảng thời gian 15-20 phút.
Ly tâm hỗn hợp vối tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút. Kết quả thu được đem hòa tan trong 4ml nước.
Dịch ly tâm sau khi đã thu kết tủa được tiếp tục thực hiện kết tủa tương tự như trên cho đến khi thu hết được enzyme trong dung dịch .
Sơ chế dịch nhựa tươi từ cây sung Ficus racemosal thành chế phẩm enzyme ficin
Dịch nhựa sung sau khi thu được pha theo tỉ lệ 1g dịch nhựa trong 2ml nước cấ. Khuấy đều dung dịch bằng máy khuấy từ trong 5 phút để enzyme ficin hòa tan hoàn toàn trong nước .
Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 3000 vòng/phút trong thời gian 10 phút để cao su đông đặc lại và lắng xuống. Loại bỏ phần lắng ở phía dưới , thu dịch nổi bên trên.
Dùng phương pháp tủa phân đoạn enzyme bằng ethanol 96% để thu lấy các phân đoạn và xác định hoạt tính enzyme trong các phân đoạn .
Những phân đoạn có hoạt tính enzyme được đưa qua lọc gel để loại bỏ tạp chất