4. GIỚI THIỆU ENZYME BROMELIN VÀ CÁCH THU NHẬN TỪ DỨA
4.3. Phương pháp thu nhận và tinh sạch Bromelin
4.3.1. Phương pháp thu nhận
Enzyme bromelin có thể thu được trong thân, trong phần thịt quả và trong chồi quả. Việc thu nhận và tinh sạch bromelin có thể thực hiện theo sơ đồ sau:
Quả dứa hoặc thân được xay nhuyễn, vắt kĩ, lọc bỏ bã và thu dịch lọc, ly tâm dịch lọc với tốc độ 6000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ chất xơ sẽ thu được dịch chiết chứa bromelin.
Tuy nhiên, khi sử dụng phương pháp siêu lọc để tinh sạch enzyme bromelin thì các hợp chất pectin ở trong dịch chiết quả sẽ làm tăng độ nhớt của dịch chiết sẽ lảm trở ngại cho quá trình lọc. Các nhà khoa học S.Sathivel, K.Niranjan và W.prinyakiwatkul đã tìm ra phương pháp đồng hóa nguyên liệu dưới điều kiện áp suất cao thì có thể phá vỡ tế bào mô dứa, giảm độ nhớt của dịch chiết, phóng thích các enzyme nội bào mà ko cần làm biến tính chúng.
Theo nghiên cứu này thì khả năng đồng hóa nguyên liệu ở 15Mpa độ nhớt trong dịch chiết giảm xuống, giá trị của độ Bx và pH thay đổi ko đáng kể, sản lượng và hoạt tín cảu enzyme gia tăng. Ở 15Mpa, sản lượng enzyme tăng gấp 2 lần (1.27g/500ml dịch chiết từ quả kể cả phần lõi) với hoạt tính cao nhất là 2.06 UI/mgso với khi đồng hóa ở điều kiện thường và ở 20Mpa thì sản lượng enzyme thu được từ vỏ quả là 0.9g/500ml dịch chiết. Vậy đồng hóa mẫu dưới áp suất cao có thể làm giảm độ nhớt của dịch chiết giúp cho việc sử dụng phương pháp siêu lọc thuận lợi hơn, đồng thời làm tăng sản lượng và hoạt tính của enzyme bromelin từ qua dứa và các phế phẩm của nó.
Các phương pháp tách bromelin
• Phương pháp kết tủa enzyme
Nguyên tắc: điểm đảng điện của đa số protein thấp hơn pH 7 do đó trong điều kiện sinh lí, các phân tử protein có tích điện âm thừa và chính những điện tích âm thừa này đã kết hợp với đầu mang điện tích dương của phân tử nước hữu cực (ở trong dung dịch, protein liên kết với 1 lượng nước khá lớn) cũng như các ion dương. Sự kết hợp với nước tạo ra 1 lớp nước bao xung quanh phân tử protein và cản trở sự kết tủa của chúng. Đối với enzyme protein cũng như các enzyme protein khác, để có thể kết tủa được enzyme, điều cần thiết là phải phá vỡ lớp nước liên kết xung quang phân từ này bằng cách bổ sung vào dung dịch protein enzyme các dung môi hoặ các hóa chất ưa nước có ái lực với nước mạnh hơn protein để lôi kéo nước ra khỏi phân tử protein đó, giúp cho protein tủa xuống.
Các dung môi thường sử dụng dể kết tủa bromelin là acetone và ethanol, còn các hóa chất khác như muối trung tính ở nồng độ cao cũng có thể kết tủa được enzyme. Ammonium sulfate là loại muối trung tính có độ hòa tan rất tốt do đó ở dung dịch bão hòa cảu muối này thì tất cả protein đều kết tủa.
Heinicker và Gortner đã dùng acetone để kết tủa bromelin từ thân và trái. Bromelin trong dung dịch nước rất nhạy cảm với các dung môi hữu cơ do đó để sự kết tủa đạt hiệu quả cao thượng tiến hành kết tủa trong điều kiện lạnh. Như vậy nước ép từ thân và trái dứa phải được làm lạnh ở 0-4oC và acetone tinh khiết ở 20oC. Ethanol cũng phải được sử dụng để kết tủa protein và hỗn hợp bromelin-ethanol cũng phải giữ ở điều kiện nhiệt độ lạnh. Sau khi thu được kết tủa, tủa protein phải được rửa bằng acetone và làm khô thật nhanh để bromelin ko bị biến tính.
Renee Tisseau đã sử dụng ammonium sulfate với nồng độ bão hòa là 0.7 (70% bão hòa) để làm tác nhân kết tủa bromelin. Sự kết hợp với tác nhân ammonium sulfate (đặc biệt ở nhiệt thấp) là 1 quá trình thuận nghịch, tủa dễ dàng hòa tan bằng nước và muối có thể được loại bỏ ra khỏi protein bằng cách thẩm tích. Phương pháp này có thể thực hiện ở nhiệt độ thường.
Để thu nhận enzyme, việc đầu tiên là phải phá vỡ tổ chức mô có chứa enzyme bằng cách nghiền các mô để thu dịch chiết cò chứa bromelin rồi sau đó dùng tác nhân khác nhau để kết tủa bromelin.
Những yếu tố chính ảnh hưởng đến hiệu suất chất lượng của chế phẩm enzyme là:
- Nồng độ ammonium sulfate - pH của dịch chiết
- Nhiệt độ kết tủa
- Thời gian tiếp xúc của tác nhân đệm và dịch chiết
Thông thường nếu sử dụng phương pháp kết tủa với ammonium sulfate thì cứ 60 kg nguyên liệu tươi sẽ thu được khoảng 1 kg bromelin thô.
Cách làm:
- Tủa bằng muối ammonium sulfate : chuẩn bị 1 lít dung dịch nước dứa sau khi li tâm, cho từ từ 532g ammonium sulfate vào và khuấy đều (dung dịch đạt độ bão hào
ammonium sulfate là 70%). Để yên ở nhiệt độ phóng 10-15 phút sau đó li tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút để thu nhận kết tủa.
- Tủa bằng ethanol: làm lạnh dung dịch nước dứa sau khi li tâm , cho ethanol 96o (cũng đã được làm lạnh) vào theo tỉ lệ 4.1 (4 nước dứa, 1 cồn), trộn đều, để ở nhiệt độ 0oC trong 3-4 giờ. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút, rửa tủa bằng acetone và thu nhận tủa.
- Tủa bằng acetone: thêm 1 thể tích acetone lạnh hoặc 20% acetone lạnh vào 1 thể tích dung dịch nước dứa sau ly tâm . Để yên trong 1 giờ ở nhiệt độ 0oC-4oC .Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút , loại bỏ tủa . Thêm 2 thể tích acetone lạnh vào , để 1 giờ 0oC-4oc ,ly tâm thu tủa và rửa tủa bằng acetone lạnh .
• Phương pháp hấp thụ
Có nhiều chất được sử dụng làm chất hấp thụ enzyme. Có thể sử sụng kaolin hay betonite để hấp thụ bromelin. Trình tự thực hiện tương tự như nhau.
Cấu tạo của kaolin: kaolin là 1 loại khoáng vật sét có khả năng hấp thụ tốt . Kaolin có cấu tạo thành từng lớp , mỗi lớp có 1 tấm tứ diện SiO44- và 1 tấm bát diên Al(OH)63-, đỉnh chung của tấm tứ diện quay về phía tấm bát diên. Ở ngay vị trí chung này thì các ion OH- của tấm bát diện được thay thế bằng ion O2- của tấm tứ diện .
Ở vị trí của 2 lớp sát cạnh nhau, các ion O2- ở bề mặt của lớp này mằn gần giữa các ion OH- ỏ bề mặt của lớp kia và do đó xuất hiện liên kết hydrogen giữa các ion trái dấu này lam cho các lớp kaolin dính sát lại gần nhau và khoảng cách giữa 2 lớp là 7.1 Ao.
Kaolon có cấu tạo thành từng lớp và có độ phân tán cao, do đó chúng có tính dẻo đặc biệt và có khả năng tạo thành kết dính. Một tính chất quan trong là do kaolin có độ phân tán cao nên nó có ảnh hưởng đến hấp phụ các chất.
Kaolin là 1 chất có tính hấp phụ tốt . Kích thước hạt nhỏ hơn 1µm do đó diện tích tiếp xúc giữa hạt kaolin và chất bị hấp phụ tăng lên rất nhiều. Một lí do khác dẫn đến khả năng hấp phụ vật chất cảu kaolin cao , là do bề mặt kaolin co rất nhiều ion OH- và O2- , những ion này có khả liên kết tương đối bền vững với các chất bị hấp phụ.
Cách làm: cho kaolin khô (hoặc đã ngâm cho trương nở) vào dung dịch nước dứa sau khi li tâm với tỉ lệ 25mg kaolin/ml dung dịch nước dứa. Khấy đều bằng máy khuấy từ, sau đó ly tâm để thu tủa. Tủa được gọi là bromelin-kaolin.
• Phương pháp siêu lọc
Siêu lọc là quá trình chảy qua 1 màng lọc dưới 1 áp suất để tách phân đoạn các
thành phần trong chất lỏng đó. Sự phân chia các phân đoạn phụ thuộc vào kích thước lỗ
tren màng và tùy theo trọng lượng phân tử của chất thấm qua. Tùy theo kích thước của
lỗ trên màng (giá trị loại từ cut-off) mà sau khi thực hiện quá trình siêu lọc sẽ thu được
nước và các chất có phân tử nhỏ còn những chất có phân tử lớn sẽ bị giữ lại trên màng.
Dung dịch enzyme sau khi thu được từ nguyên liệu thực vật sẽ có chứa những tạp chất có trọng lượng phân tử khác nhau. Đầu tiên sử dụng phương pháp lọc để loại trừ các chất bển. Sau đó chyển sang dùng phương pháp siêu lco5 thì sẽ loại được các chất có trọng lượng phân tử thấp hơn các protein enzyme và đồng thời cô đặc được enzyme.
Phương pháp siêu lọc được sử dụng trong ngành công nghệ thực phẩm và các quá trình sản xuất sinh học để tách các chất dễ bị biến tính bởi nhiệt như lọc và ổn định rượu vang , lọc nươc ép trái cây , cô đặc sữa làm phô mai, làm bơ, cô đặc lòng trắng trứng , cô đặc huyết thanh động vật và tinh sạch các chất pectin, gum, gelatin… cô đặc và tinh sạch các enzyme, kháng thể, polysaccharide, polipeptide, vaccine… thu hồi các protein và các cacbonhydrat từ nước thải và các sản phẩm phụ .
Màng siêu lọc: màng siêu lọc được cấu tạo bởi các sợi giống. Trong mỗi sợi giống lại có nhiều sợi giống xếp song song và gắn chặt với lớp ngoài tạo thành các lỗ để các chất thấm qua. Các sợi này được chế tạo từ polime bền như fluoro polimer ( FS), cellulose acetate (CA), polysulphone (GR)… Tùy theo mục đích cụ thể mà người ta sử dụng loại màng thích hợp. Ví dụ cô đặc protein: dùng màng FS, GR, cô đặc enzyme dùng màng GR.
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình siêu lọc: trong quá trình siêu lọc cần chú ý đến các yếu tố sau:
- Nhiệt độ: nhiệt độ phải thích hợp với sản phẩm và loại màng sử dụng. Khi chọn nhiệt độ cần lưu ý đến khả năng kết tủa của protein và sự tăng nhiệt độ trong quá trình siêu lọc vì các yếu tố này có thể làm bít màng.
- Áp suất: thường tốc độ của dỏng chảy (số lít chất lỏng chảy qua 1m2 màng trong 1 giờ) sẽ tăng cùng với sự gia tăng áp suất cho đến khi đạt giá trị tốc độ cực đại. Nếu áp suất tăng cao hơn thì tốc độ dòng chảy sẽ giảm. Người ta đề nghị tốc độ dòng chảy nên được chỉnh từ 4-5 lít/phút, tương ưng với hiệu số PI1 – PI2 ở trong khoảng 0.5- 3bar. Áp suất dòng vào lớn nhất (PI1 max) là 7bar (tương ứng 102Psi), áp suất dòng ra nhỏ nhất (PI2 min) là 0.5bar (tương ứng 7.25bar).
Các kiểu siêu lọc : có 3 kiểu hệ thống siêu lọc - Kiểu 1 bước (single pass oparation)
- Kiểu lô (batch operation): chất lỏng được tuần hoàn qua màng đến nòng độ của dịch cô đặc ở trong chậu chứa đạt được như yêu cầu.
- Kiểu thể tích ko đổi (constant volume operation): dòng chất lỏng được cung cấp liên tục đạt thể tích ở trong chậu chứa ko thay đổi và chất lỏng được tuần hoàn qua màng đến nồng độ dịch cô ở trong chậu chứa đạt được như yêu cầu.
Những thuận lợi của phương pháp siêu lọc
- Có thể chọn lựa màng thích hợp với tùng mục đích cụ thể.
- Đối với enzyme: enzyme có thể cô đặc 25 lần mà ko bị mất hoạt tính.
- Quá trình siêu lọc vừa làm cô đặc, vừa tinh sạch được enzyme. Trong quá trình thực hiện nếu them nước vào thì độ tinh sạch cảu enzyme càng cao.
Trong quá trình siêu lọc, nhiệt độ cao có thể làm mất hoạt tính của enzyme, do đó nhiệt độ 10-20oC được xem là khoảng nhiệt độ thích hợp nhất cho năng suất mà ko làm mất hoạt tính enzyme. Quá trình siêu lọc có thể thực hiện tốt ngay ở nhiệt độ thấp (5oC).
Cách làm :
Sử dụng màng FS 50PP có giá trị loại trừ (cut-off) 30000, diên tích màng 336 cm2.
Dịch nước dứa sau khi ly tâm được cho qua siêu lọc, trong quá trình này thêm nước cất vào để tinh sạch và thu được dung dịch cô đặc. Thu nhận tủ bằng cách sử dụng acetone và sấy thăng hoa dung dịch cô đặc.
Các quá trình thu nhận bromelin
Thu nhận bromelin bằng phương pháp sử dụng cacbonul methyl cellulose (CMC). Phương pháp tách bromelin bằng CMC cho phép thu được bromelin ở dạng bột trắng có hoạt tính cao, thời gian nhanh và đơn giản hơn so với các phương pháp khác.
Công nghệ chế tạo CM: CMC được chế tạo từ vải màn, bông, vải, gạc loại tốt. Cân 300g vải mềm hay gạc ngâm trong 2 lít dung dịch NaOH 45% trong 10 phút, thỉnh thoảng trộn cho đều, thêm 2 lít dung dịch monochoacetic 15% cho vào thành 4 lần, vùa cho vừa đảo trộn đều. Đun cách thủy hỗn hợp ở nhiệt độ 60oC trong thời gian 30 phút. Sau đó làm lạnh băng nước đá đến khi hỗn hợp có màu vàng. Thêm vào đó 100mldung dịch acetic axit 10% từ từ từng ít một. Sau 2 giờ pha loãng với nước cất đến 20 lít. Để yên gạn bỏ rồi thêm nước dung dịch acetic axit rồi rửa lại axit. Ngâm trong H2SO4 0.1N trong thời gian 48 giờ, sau đó rửa băng nước cất đến pH trung tính, sấy khô ở 50oC. Quá trình phản ứng xảy ra như sau:
Tách chiết bromelin từ dịch chiết dứa bằng CMC
CMC vải màn được tẩm ướt bằng dung dịch đệm phosphate 0.005M, pH 6.1, sau đó cho dịch chiết dứa vào thỉnh thoảng khuất trộn. Sau 2 giờ lấy ra vắt kiệt, vẩy sạch chất bển bám vào CMC rửa protein bằng đệm photphate 0.05M, pH 6.5. Sau đó tiến hành phản ứng hấp phụ lần thứ nhất, cho dung dịch phản ứng hấp phụ là đệm phosphate 0.05M , pH 7.1 và NaCl 0.5 khuấy trộn 3-4 lần. Sau 2 giờ lấy ra vắt kiệt thì thu được dung dịch đậm đặc chứa bromelin. Tiếp tục phản ứng hập phụ lần thứ 2 như lần thứ nhất. Sau đó gộp các dịch chiết lại và tủa bằng acetone hay cồn lạnh để tách lấy enzyme.
Với phương pháp này hiệu suất thu đạt 0.1% so với chồi dứa tươi có hoạt tính 24 nk/mg chế phẩm enzyme. So với tủa (NH4)2SO4 thì độ sạch chế phẩm enzyme cao hơn gấp 2 lần , thời gian tiến hành nhanh hơn và tiến hành thuận lợi.
4.3.2. Phương pháp tinh sạch enzyme bromelin
Enzyme bromelin được tinh sạch bằng phương pháp thẩm tích, lọc qua sephadex, phương pháp sắc kí.
Tinh sạch bằng phương pháp thẩm tích
Cân 1g enzyme thô, pha trong 100ml dung dịch đệm sodium phosphate 0.03M có pH 7.2. Sau khi tất cả enzyme đã hòa tan thì cho hỗn hợp vào túi cellophane rồi đặt túi vào cốc có chứa 1 lít dung dịch đệm sodium phosphate 0.03M , pH 7.2. Túi cellophane đực chuẩn bị bằng cách trước khi dùng được tráng đầy bằng dung dịch đệm tương tự trên. Tiến hành thẩm tích trong 6 gờ và cứ sau 2 giờ thay đổi đệm bên ngoài 1 lần. Dung dịch đệm phái ngoài túi được khuấy liên tục bằng 1 mày khuấy từ.
Trong quá trình thẩm tích, khi thay đồi nhiệt độ trong 1 giới hạn nhất định thì vận tốc khếch tán sẽ tăng theo sự gia tăng nhiệt độ. Nhưng nếu sự gia tăng nhiệt độ vượt quá mức cho phép thì protein enzyme bị biến tính do nhiệt độ cao làm ảnh hưởng đến những mối tương tác giúp cho sự ổn định cấu trúc enzyme. Chính vù vậy để làm giảm sự biến tính của enzyme do nhiệt , người ta thường tinh sạch enzyme ở nhiệt độ thấp.
Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex
• Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex G-50
Saphadex G-50 được đun cách thủy ở 100oC trong 1 giờ rồi nhồi vào cột kích thước (kích thước cột 23.5 x 0.9 cm). Đặt 1 cái phểu thủy tinh phía trên cột m cho sephadex từ từ vào phễu và khuấy liên tục. Các hạt sẽ lắng từ từ xuống cột , chú ý phải khuấy liên tục đến khi nhồi xong cột. Khi nhồi cột phải cố gắng nhồi sao cho mật độ hạt đồng nhất và ko có bọt khí. Trong quá trình nhồi cột vẩn phải xả cột trong 1 giờ với vận tốc 1ml/7 phút.
Cân 100mg enzyme thô vào trong 1ml dung dịch đệm sodium phosphate 0.03M, pH 7.2 Khi enzyme đã hòa tan hoàn toàn chi cho hỗn hợp enzyme từ từ vào cột. Cho dung môi phân ly enzyme qua cột và điều chỉnh tốc độ chảy khoảng 2ml/7phút . Loại bỏ 5ml đầu tiên rồi mới bắt đầu thu dịch enzyme. Dịch enzyme thu được đến khi dùng
