5. GIỚI THIỆU ENZYME FICIN VÀ CÁCH THU NHẬN TỪ SUNG
5.3.2. Một số phương pháp chiết tách enzyme
Phương pháp chiết tách enzyme dựa vào tính hòa tan
Người ta có thể sử dũng nhiều chất khác nhau để tủa protein như ammonium sulfate, Pi, dung môi hữu cơ: ethanol 96% acetone.
Tủa phân đoạn enzyme băng dung môi hữu cơ (ethanol 96% acetone)
Mục đích: thu nhận enzyme hay protein từ dung dịch bằng cách sử dụng các dung môi hữu cơ.
Nguyên tắc: có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến độ hòa tan của protein trong dung môi, trong đó hằng số điện môi của dung dịch. Những dung môi có hằng số điện môi lớn như nước hay dimethylsulfoxide có thể ổ định mối tương tác giữa các phân tử của dung môi với các phân tử protein, giúp cho sự hòa tan của protein trong dung dịch. Các dung môi có hằng số điên môi nhỏ ( acetone, ethanol…) ngược lại sẽ ngăn cản sự phân tán các phân tử protein trong dung dịch. Vì vậy, khi bổ sung dung môi hữu cơ vào dung dịch enzyme sẽ làm giảm khả năng hòa tan của enzyme và dẫn đến sự kết tủa.
Ethanol 96% và acetone thường được sử dụng để kết tủa enzyme do chúng ở dạng tinh khiết , ít bị lẫn tạp chất và giá tương tối rẻ. Mặt khác các dung môi này dễ bay hơi do đó dễ dàng tách bỏ dung môi ra khỏi chế phẩm enzyme bằng cách sấy nhẹ hay bằng quạt gió.
Hóa chất:
- Dung dịch chứa enzyme cần tinh sạch - Acetone
- Ethanol 96% Cách làm:
Hút 4 ml dung dịch chứa enzyme cần tinh sạch vào ống nghiệm .
Vừa khuấy, vừa nhỏ từ từ dung môi (acetoe hay ethanol 96%) đến khi bắt đầu xuất hiện kết tủa (các hạt kết tủa bám vào thành ống nghiệm). Chú ý khuấy mạnh tay để tránh hiện tượng kết tủa cục bộ.
Để yên dung dịch sau khi tủa trong khoảng 1 thời gian 15-20 phút.
Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút. Kết tủa thu được đem hòa tan trong 4ml nước.
Dịch ly tâm sau khi đã thu kết tủa được tiếp tục thục hiện kết tủa tương tự như trên cho đến khi thu hết được enzyme trong dung dịch .
Mục đích: thu nhận proteinhay enzyme từ dung dịch bằng cách sử dụng 1 lượng thừa dung dịch muối \.
Nguyên tắc: tính hòa tan của enzyme ngoài sự phụ thuộc vào hằng số điện môi cảu dung dịch, nó còn phụ thuộc vào nồng độ muối trong dung dịch. Khi nồng độ muối trong dung dịch thấp, các phân tử muối giúp ổn định các nhóm chức năng khác nhau của phân tử protein do đó giúp cho tính hòa tan của enzyme trong dung dịch và làm tăng tính hòa tan cảu protein. Nồng độ muối tăng thì độ hòa tan cảu protein càng tăng. Tuy nhiên khi nồng độ muối tăng quá cao sẽ làm giảm độ hòa tan của enzyme và khi ko còn đủ lượng nước cần thiết để tương tác với các phân tử protein thì protein bắt đầu kết tủa.
Hóa chất:
- Dung dịch chứa enzyme cần thu - dung dịch ( NH4)2SO4 bão hòa Cách làm:
Hút 4 ml dung dịch cần kết tủa vào ống nghiệm
Vừa khuấy vừa nhỏ từng giọt dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa vào dung dịch enzyme bằng ống hut có chia độ hay ống chuẩn độ cho đến khi bắt đầu xuất hiện kết tủa (các hạt kết tủa bám vào thành ống nghiệm) để quá trình kết tủa protein đạt đến sự ổn định cần để yên dung dịch sau khi tủa 1 khoảng thời gian 15-20 phút.
Ly tâm hỗn hợp vối tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút. Kết quả thu được đem hòa tan trong 4ml nước.
Dịch ly tâm sau khi đã thu kết tủa được tiếp tục thực hiện kết tủa tương tự như trên cho đến khi thu hết được enzyme trong dung dịch .
Sơ chế dịch nhựa tươi từ cây sung Ficus racemosal thành chế phẩm enzyme ficin
Dịch nhựa sung sau khi thu được pha theo tỉ lệ 1g dịch nhựa trong 2ml nước cấ. Khuấy đều dung dịch bằng máy khuấy từ trong 5 phút để enzyme ficin hòa tan hoàn toàn trong nước .
Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 3000 vòng/phút trong thời gian 10 phút để cao su đông đặc lại và lắng xuống. Loại bỏ phần lắng ở phía dưới , thu dịch nổi bên trên.
Dùng phương pháp tủa phân đoạn enzyme bằng ethanol 96% để thu lấy các phân đoạn và xác định hoạt tính enzyme trong các phân đoạn .
Những phân đoạn có hoạt tính enzyme được đưa qua lọc gel để loại bỏ tạp chất trong các phân đoạn enzyme.
Các phân đoạn sau khi qua cột gel sẽ được xác định lại hoạt tính, trộn với tinh bột tỉ lệ 1:1 rồi sấy khô ở nhiệt độ 40oC. Chế phẩm enzyme thu được ở dạng bột sẽ được bảo quan ở nhiệt độ 0-4oC.
Sơ đồ tổng quát quy trình thu nhận ficin từ nhựa sung 5.3.3. Các phương pháp tinh sạch enzyme ficin
5.3.3.1. Phương pháp lọc gel
Phương pháp lọc gel hay sắc kí ray phân tử là 1 loại sắc kí được sử dụng để tách, phân tích, xác định kích thước, trọng lượng, phân tử của các chất cao phân tử ,nó cũng được sử dụng để điều chế và tinh sạch protein.
Gel là một mạng lưới phân tử có cấu trúc ko gian 3 chiều ghép hở ở dạng hạt . trên hạt có những lỗ kích thước trong 1 chừng mực nào đó mà chỉ có những phân tử có kích thước nhỏ hơn có thể đi qua, còn các chất có kích thước lớn hơn lỗ thì ko thể đi qua được.
Nguyên tắc: phương pháp này được sử dụng để tách các phân tử có trọng lượng khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel. Những phân tử nào có kích thước nhỏ hơn lỗ trên hạt gel thì sẽ lọt vào trong lỗ do đó kah3 năng di chuyển qua cột sẽ chậm đi, còn các phân tử lớn hơn kích thước lỗ sẽ di chuyển bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh hơn và sẽ được súc giải ra khỏi cột sớm hơn các pahn6 tử nhỏ.
Hiện nay có các loại saphadex được dùng để tách các chất có trọng lượng phân tử khác nhau:
Sephadex G75: dùng để tách các hỗn hợp phân tử có trọng lượng phân tử 10000 – 40000 Dalton .
Sephadex G100: dùng để tách các hỗn hợp phân tử có trọng lượng phân tử 20000 – 50000 Dalton .
Sephadex G200: dùng để tách các hỗn hợp phân tử có trọng lượng phân tử 30000 – 100000 Dalton .
Hiện nay còn có các loại sephadex từ G10-200 có độ xốp thay đổi từ độ xốp nhỏ nhất đến độ xốp lớn nhất để tách các chất khác nhau.
Sephadex là tên thương mại cảu detran mạng akyl hóa. Khi các nhóm hydroxy
được akyl hóa thì sephadex sẽ trở nên kị nước hơn nên khi sẽ trương nở khi được ngâm trong vài dung môi phân cực. Đây là 1 loại bột khô ko tan trong nước và khi được ngâm vào nước nó sẽ ngậm nước và trương nở. Các loại sephadex được sử dụng hiện nay chỉ trương nở trong nước và 1 vài dung môi phân cực và chúng ko trương trong methanol, ethanol, acetic axit. Sephadex ko tương tác với các ion do đó nó trung hòa về điện tích. Nếu sephadex bị oxi hóa mạnh trogn các dung dịch thì hạt gel sẽ bị phá vỡ, còn trong dung dịch axit mạnh thì các glycoside trong gel sẽ bị thủy phân.
Cách làm :
Nhồi cột: nhâm gel sephadex trong G75 trong dung dịch NaN3 0.02% trong 24 giờ để gel trương nở hoàn toàn.
Cho dung dịch đệm vào cột
Cho một lợp gòn thủy tinh vào cột, đổ gel từ từ vào cột đến chiều cao cần thiết. Trong quá trình đổ gel vào cột phải khuấy đều gel để gel được đồng nhất và chú ý phải
luôn luôn có 1 lớp dung dịch đểm ở trên mặt để ngăn cản hiện tượng khô gel. Đặt lên gel 1 lớp giấy lọc.
Để cột ổn định trong vài giờ, rửa cột bằng dung dịch đệm phosphate .
Nạp mẫu: cân mẫu và hòa tan mẫu vào 3-5ml dung dịch đệm pH 6.1 sao cho nồng độ protein khoảng 10mg/ml
Nạp mẫu vào cột sau khi hết mẫu vẫn tiếp tục cho dung dịch đệm qua cột.
Thu mẫu vào ống nghiệm , mỗi ống nghiệm chứa 2.5ml . Mỗi phân đoạn được thu trong thời gian 5-10 phút , đem các phân đoạn đi đo OD 280nm . Dồn chung những phân đoạn nào có sự hiện diện của enzyme để đo hoạt tính và xác định hàm lượng enzyme.
5.3.3.2. Phương pháp điện di mini-gel SDS-polyacrylamide
Phương pháp này cũng có thể xác định được trọng lượng phân tử của các protein cũng như có thể xác định độ tinh sạch của chế phẩm enzyme khi kết hợp với phương pháp sắc kí.
Nguyên tắc: trong hệ thống này, khi cho hỗn hợp protein vào thì các protein sẽ kết hợp với các chất bề mặt mang điện tích âm là SDS (sodium dodecyl sulfate) để trở thành các phức hợp mang điện tích âm bởi vì điện tích trên SDS lấn át các điện tích trên phân tử protein. SDS sẽ kết hợp với protein do đó phức hợp này sẽ tỉ lệ với kích thước của protein đó. Phức hợp này sẽ di chuyễn về hướng cực dương và tốc độ di chuyển phụ thuộc vào kích thước phức hợp. Mặt khác, các cầu nối –S-S cảu phân tử protein bị phá vỡ bởi các chất khử là mercapthoethanol và dithithreitol do đó khi ở trong cùng 1 điều kiện thì sự di chuyển của các phân tủ protein chỉ phụ thuộc vào kích thước và những phân tử protein có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn các phân tử protein có kích thước nhỏ hơn.
Trong phương pháp điện di này, người ta có thể xác định trong lượng phân tử protein và đánh giá độ tinh sạch của protein bằng cách so sánh với 1 thang phân tử chuẩn, đó là 1 hỗn hợp gồm nhiều protein có trọng lượng phân tử đã biết.
Như vậy tốc độ di chuyển của các phân tử protein trong phương pháp này phụ thuộc vào:
- Điện tích của mỗi phân tử (điện tích này thay đổi theo pH môi trường, do đó cần phải sử dụng dung dịch đệm để ổn định pH).
- Hình dạng và trọng lượng phân tử. - Cường độ điện trường
- Nhiệt độ
- Tính chất của giá mang
Người ta có thể sử dụng lớp gel gom để dồn các protein trong mẫu lại thành băng mỏng hoặc sử dụng gel phân tích để tách các protein ra thành từng băng có kích thước khác nhau từ cùng 1 điểm xuất phát ban đầu.
Cách làm:
Chuẩn bị hóa chất :
Dung dịch acrylamide: 30g acrylamide (FW 71.08), 0.8g bis-acrylamide (FW 154.2), 100ml nươc cất. Hòa ta tất cả với nhau và chỉ sử dụng 20ml dung dịch acrylamide để tiến hành thí nghiệm.
Chú ý: cần phải mang găng tay trong quá trình thao tác do chất này có khả năng gây ung thư .
Đệm gel phân tích Tris-HCl 1.5M, pH 8.8
Hòa tan 3.63g Tris (FW 121.1) trong 15ml nước cất Chỉnh pH xuống 8.8 bằng HCl 4M
Thêm nước vào cho đủ 20ml
Đệm của gel gom ( tris-HCl 0.5M, pH 6.8)
Hòa tan 1.5g Tris (FW 121.1) trong 20ml nước cất Chỉnh pH xuống 6.8 bằng HCl 4M
Thêm nước vào cho đủ 25ml
Dung dịch SDS (10%), hòa tan 1g SDS trong nước cất thành 10ml dung dịch . Dung môi pha mẫu: 2.5ml đệm gel gom, 4ml dung dịch SDS 10%, 2ml glycerol, 2mg bromphenol blue, 1ml β-mercapto ethanol. Thêm nước cất vào thành 10ml.
Đệm điện di: 3.028 g Tris (FW 121.1), 14.413 glycine, 1g SDS hòa tan với nước cất thành 1 lít, pH dung dịch 8.3.
Dung dich nhuộm protein: 0.625 Coomassie Blue R250, 112,5ml methanol tuyệt đối, 25ml glacial acetic axit, 112.5ml nước cất. Tổng công dung dịch là 250ml
Dung dịch rửa mẫu: 100ml glacial acetic axit, 100ml methanol, thêm nước đủ 1 lít.
Tiến hành:
Chuẩn bị mẫu: hòa tna mẫu khô hay dung dịch trong dung môi pha mẫu để có được nồng độ protein khoảng 1mg/ml dung dịch pha mẫu. Đun sôi cách thủy hỗn hợp trong 5 phút, để nguội, cho vào các giếng cảu gel.
Chuẩn bị gel phân tách (10ml) Đệm gel phân tách: 2.5ml Dung dịch acrylamide: 4.15ml Amonium persulfate: ít tinh thể Nước cất: 3.2ml
SDS 10%: 0.1ml TEDMED: 3.3µl
Lắc nhẹ cho tan hết rồi dung pipette đưa gel phân tách vào khoảng giữa 2 tấm kính cho đến lúc gel cao khoảng 8cm (chú ý ko để có bọt khí). Cho 1 lớp nước cất lên gel, chờ gel đông lại.
Chuẩn bị gel gom: Đệm gel gom: 0.5ml
Dung dịch acryamide: 0.3ml
Amonium persulfate: ít tinh thể (1µl) Nước cất: 1.18ml
SDS 10%: 20µl TEDMED: 1µl Lắc nhẹ cho tan hết
Sau khi gel phân tách đông lại, hút bỏ phần nước cất ở trên rồi dùng pipette đưa gel gom vào khuôn. Lúc này đưa lược vào khuôn để tạo giếng. khi gel gần đông, nhẹ nhàng lấy lược ra rồi lắp khuôn gel vào bộ điện di.
Tiến hành điện di: cho dung dịch điện di vào 2 buồng điện di, bơm từ từ 5-15µl mãu vào các giếng. Chạy điện di (điện thế khoảng 150-220v và cường độ dòng điện khoảng 15-30mA). Sau khoảng 1 giờ, thì thấy vạch màu chỉ thị di chuyển xuống đến gần đáy cảu gel thì ngắt điện và tiến hành nhuộm gel.
Nhuộm gel: ngâm gel trong dung dịch thuốc nhuộm protein, lay nhẹ cho thuốc nhuộm nhấm vào gel (1-4 giờ). Chuyển gel sang dung dịch rửa màu, thay dung dịch vài lần đến gel trong suốt và các vạch màu xanh xuất hiện tại các vị trì protein. Chụp hình và ghi nhận kết quả.
6. GIỚI THIỆU ENZYME PAPAIN VÀ CÁCH THU NHẬN TỪ ĐU ĐỦ6.1. Giới thiệu về enzyme papain 6.1. Giới thiệu về enzyme papain
6.1.1. Đặc điểm chung
Papain là cysteine protease được biết đến nhiều nhất và được phân lập lần đầu tiên vào năm 1879 từ nhựa trái đu đủ (Carica papaya). Đây cũng là enzyme đầu tiên được xác định cấu trúc tinh. Trong nhựa đu đủ ngoài enzyme papain còn có các loại protease khác như chymopapain, caricain, glycyl endopeptidase và một số enzyme khác. Nhựa đu đủ có hàm lượng và hoạt tính papain cao nhất tập trung ở vùng có nắng nóng và độ ẩm ổn định quanh năm.
- Cysteine proteases là nhóm các protein có trọng lượng phân tử trong khoảng 21-30kDa, các protein này có khả năng xúc tác để thủy phân các loại liên kết: peptide, amide, esterthiol. Đây cũng là những enzyme có nhóm –SH trong tâm hoạt động.
- Người ta đã tìm thấy hơn 20 họ cysteine proteases (Barrett, 1994) và nhiều enzyme trong số này (papain, bromelain, ficain, animal cathepsins) được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp.
- Có 2 loại cysteine proteases là exopeptidase ( cathepsin X, carboxypeptidase B) và endopeptidases (bromelain, ficain, cathepsin…). Exopeptidase thủy phân liên kết peptide ở đầu N hoặc đầu C tự do trong khi đó endopepetidase cắt đứt các liên kết peptide ở giữa chuỗi polypeptide.
Nhựa cây đu đủ nằm trong các ống dẫn nhựa trải rộng khắp toàn bộ cây, ngoại trừ rễ. nhựa là hỗn hợp enzyme chứa các protease sau: papain, chymopapain A( gốc amino acid cuối là glutamic acid), chymopapain B (gốc amino aicd là tyrosine), proteinase III, proteinase IV, thilprotesase, trong đó papain chiếm tới 95%.
Tính chất vật lý Giá trị Điểm đẳng điện pI = 8.75 Hằng số sa lắng S20 2.42 ± 0.04 Hằng số phân tán D20 (10-7giây.cm2) 10.27 ± 0.13 Phân tử lượng 20,700 Độ triền quang [α]D -66.70 Độ xoắn 17% Vòng hiệu ứng cotton 290nm Thể tích riêng phần V(mL/g) 0.724 Trị số ma sát f/fo 1.16
Bột màu vàng hay màu nâu nhạt, tùy thuộc phương pháp sấy, không tan trong hầu hết các chất hữu cơ nhưng tan một phần trong H2O hay glycerine. Bền nhiệt.
6.1.3.Tính chất hóa học
Cấu tạo hóa học
Papain là 1 endoprotease có chứa 16% N và 1.2% S. Papain là 1 protease thiol, theo nghiên cứu của R. L. Hill và E. L Smith, papain là 1 chuỗi polypeptide gồm 185 amino acid, trọng lượng phân tử là 20.900 Dalton.
Bảng 6.1: Thành phần hóa học của papain
Amino acid Số lượng Amino acid Số lượng
Alanine 13 Lyeine 9
Arginine 10 Proline 4
Aspartic acid 17 Serine 9
Half – Cysteine 6 Threonie 11
Glutamid acid 17 Tryptophan 7
Glycine 23 Tyrosine 5
Histidine 2 Valine 17
Isoleucine 10 Methionine 15
Leucine 10 0
Tổng cộng: 185
Theo kết quả phân tích bằng tia X, phân tử papain được cấu tạo bởi 212 acid amin trong đó không có chứa methionine. Phân tử lượng khoảng 23,350 Da, phân tử là một mạch polypeptide với đầu N là isoleucine, đầu C là asparagine, có 6 gốc cysteine tạo thành 3 cầu disulfur ở các vị trí 22-63, 56-95, 153-200 không có chức năng sinh học, chỉ làm tăng tính bền vững của cấu trúc và một nhóm –SH tự do ở vị trí 25.