5. GIỚI THIỆU ENZYME FICIN VÀ CÁCH THU NHẬN TỪ SUNG
5.3.3.2. Phương pháp điện di mini-gel SDS-polyacrylamide
Phương pháp này cũng có thể xác định được trọng lượng phân tử của các protein cũng như có thể xác định độ tinh sạch của chế phẩm enzyme khi kết hợp với phương pháp sắc kí.
Nguyên tắc: trong hệ thống này, khi cho hỗn hợp protein vào thì các protein sẽ kết hợp với các chất bề mặt mang điện tích âm là SDS (sodium dodecyl sulfate) để trở thành các phức hợp mang điện tích âm bởi vì điện tích trên SDS lấn át các điện tích trên phân tử protein. SDS sẽ kết hợp với protein do đó phức hợp này sẽ tỉ lệ với kích thước của protein đó. Phức hợp này sẽ di chuyễn về hướng cực dương và tốc độ di chuyển phụ thuộc vào kích thước phức hợp. Mặt khác, các cầu nối –S-S cảu phân tử protein bị phá vỡ bởi các chất khử là mercapthoethanol và dithithreitol do đó khi ở trong cùng 1 điều kiện thì sự di chuyển của các phân tủ protein chỉ phụ thuộc vào kích thước và những phân tử protein có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn các phân tử protein có kích thước nhỏ hơn.
Trong phương pháp điện di này, người ta có thể xác định trong lượng phân tử protein và đánh giá độ tinh sạch của protein bằng cách so sánh với 1 thang phân tử chuẩn, đó là 1 hỗn hợp gồm nhiều protein có trọng lượng phân tử đã biết.
Như vậy tốc độ di chuyển của các phân tử protein trong phương pháp này phụ thuộc vào:
- Điện tích của mỗi phân tử (điện tích này thay đổi theo pH môi trường, do đó cần phải sử dụng dung dịch đệm để ổn định pH).
- Hình dạng và trọng lượng phân tử. - Cường độ điện trường
- Nhiệt độ
- Tính chất của giá mang
Người ta có thể sử dụng lớp gel gom để dồn các protein trong mẫu lại thành băng mỏng hoặc sử dụng gel phân tích để tách các protein ra thành từng băng có kích thước khác nhau từ cùng 1 điểm xuất phát ban đầu.
Cách làm:
Chuẩn bị hóa chất :
Dung dịch acrylamide: 30g acrylamide (FW 71.08), 0.8g bis-acrylamide (FW 154.2), 100ml nươc cất. Hòa ta tất cả với nhau và chỉ sử dụng 20ml dung dịch acrylamide để tiến hành thí nghiệm.
Chú ý: cần phải mang găng tay trong quá trình thao tác do chất này có khả năng gây ung thư .
Đệm gel phân tích Tris-HCl 1.5M, pH 8.8
Hòa tan 3.63g Tris (FW 121.1) trong 15ml nước cất Chỉnh pH xuống 8.8 bằng HCl 4M
Thêm nước vào cho đủ 20ml
Đệm của gel gom ( tris-HCl 0.5M, pH 6.8)
Hòa tan 1.5g Tris (FW 121.1) trong 20ml nước cất Chỉnh pH xuống 6.8 bằng HCl 4M
Thêm nước vào cho đủ 25ml
Dung dịch SDS (10%), hòa tan 1g SDS trong nước cất thành 10ml dung dịch . Dung môi pha mẫu: 2.5ml đệm gel gom, 4ml dung dịch SDS 10%, 2ml glycerol, 2mg bromphenol blue, 1ml β-mercapto ethanol. Thêm nước cất vào thành 10ml.
Đệm điện di: 3.028 g Tris (FW 121.1), 14.413 glycine, 1g SDS hòa tan với nước cất thành 1 lít, pH dung dịch 8.3.
Dung dich nhuộm protein: 0.625 Coomassie Blue R250, 112,5ml methanol tuyệt đối, 25ml glacial acetic axit, 112.5ml nước cất. Tổng công dung dịch là 250ml
Dung dịch rửa mẫu: 100ml glacial acetic axit, 100ml methanol, thêm nước đủ 1 lít.
Tiến hành:
Chuẩn bị mẫu: hòa tna mẫu khô hay dung dịch trong dung môi pha mẫu để có được nồng độ protein khoảng 1mg/ml dung dịch pha mẫu. Đun sôi cách thủy hỗn hợp trong 5 phút, để nguội, cho vào các giếng cảu gel.
Chuẩn bị gel phân tách (10ml) Đệm gel phân tách: 2.5ml Dung dịch acrylamide: 4.15ml Amonium persulfate: ít tinh thể Nước cất: 3.2ml
SDS 10%: 0.1ml TEDMED: 3.3µl
Lắc nhẹ cho tan hết rồi dung pipette đưa gel phân tách vào khoảng giữa 2 tấm kính cho đến lúc gel cao khoảng 8cm (chú ý ko để có bọt khí). Cho 1 lớp nước cất lên gel, chờ gel đông lại.
Chuẩn bị gel gom: Đệm gel gom: 0.5ml
Dung dịch acryamide: 0.3ml
Amonium persulfate: ít tinh thể (1µl) Nước cất: 1.18ml
SDS 10%: 20µl TEDMED: 1µl Lắc nhẹ cho tan hết
Sau khi gel phân tách đông lại, hút bỏ phần nước cất ở trên rồi dùng pipette đưa gel gom vào khuôn. Lúc này đưa lược vào khuôn để tạo giếng. khi gel gần đông, nhẹ nhàng lấy lược ra rồi lắp khuôn gel vào bộ điện di.
Tiến hành điện di: cho dung dịch điện di vào 2 buồng điện di, bơm từ từ 5-15µl mãu vào các giếng. Chạy điện di (điện thế khoảng 150-220v và cường độ dòng điện khoảng 15-30mA). Sau khoảng 1 giờ, thì thấy vạch màu chỉ thị di chuyển xuống đến gần đáy cảu gel thì ngắt điện và tiến hành nhuộm gel.
Nhuộm gel: ngâm gel trong dung dịch thuốc nhuộm protein, lay nhẹ cho thuốc nhuộm nhấm vào gel (1-4 giờ). Chuyển gel sang dung dịch rửa màu, thay dung dịch vài lần đến gel trong suốt và các vạch màu xanh xuất hiện tại các vị trì protein. Chụp hình và ghi nhận kết quả.