3. Nội dung của đề tài
2.6.Phƣơng pháp sử lý số liệu
35
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân tích biểu hiện tạm thời của gen gus
Gen -glucuronidase (gus, uidA) đƣợc phân lập từ chủng E. coli RAJ201 trong plasmit pRAJ220. Gen gus mã hoá enzym -glucuronidase có khả năng thuỷ phân cơ chất -glucuronide thành sản phẩm có khả năng tạo màu xanh chàm dễ quan sát. Dựa vào ứng dụng này của gen gus, các nhà khoa học đã thiết kế gen gus
vào các vectơ chuyển gen để làm gen chỉ thị dễ thấy ở mô và tế bào thực vật mang gen chuyển [43]. Hiện nay có rất nhiều vector chuyển gen vào thực vật thông dụng đƣợc thiết kế có mang gen gus nhƣ pBI121, pCAM1301, PTN289... Các hệ vector này thƣờng đƣợc thiết kế có đoạn intron ở đầu 5‘ trƣớc gen gus và cho phép gen này chỉ biểu hiện trong tế bào thực vật.
Nhằm mục đích hoàn thiện phƣơng pháp chuyển gen và kiểm tra trƣớc khả năng biến nạp thành công gen cry3 vào rễ tơ khoai lang thông qua vi khuẩn A. rhizogens, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu biểu hiện tạm thời của gen gus ở các mảnh lá cuống lá sau thời gian đồng nuôi cấy với A. rhizogens có vector pPTN289 mang gen gus (pPTN289/Gus), là gen chỉ thị mã hóa enzyme glucuronidase, enzyme này sẽ phân giải cơ chất X-Gluc (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D- glucuronide cyclohexylamine) và chuyển thành màu xanh các mô mang gen chuyển. Sau hai ngày đồng nuôi cấy, chúng tôi tiến hành cấy chuyển các mảnh mô sang môi trƣờng WPM có bổ sung Cefotaxime 500 mg/L.
Để phân tích sự có mặt của gen gus, các mảnh mô đƣợc ngâm trong cơ chất X-Gluc (5-bromo-chloro-3-indolyl--D-glucuronide) ở 370C trong 8-12 giờ. Kết quả để xác định các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng chuyển gen vào khoai lang và đánh giá hiệu quả chuyển gen thông qua A. Rhizogens
3.1.1. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen vào khoai lang
Để tối ƣu hóa thời gian lây nhiễm chúng tôi tiến hành bố trí thí nghiệm nhƣ sau. Các mảnh lá đƣợc làm tổn thƣơng và ngâm với dịch huyền phù vi khuẩn
36
(chuẩn bị theo mục 2.2.1.1) pha loãng tới OD600 = 0,8 ở nhiệt độ phòng trong các khoảng thời gian 10 phút, 20 phút, 30 phút. Kết thúc thời gian lây nhiễm mẫu đƣợc thấm khô bằng giấy thấm vô trùng và chuyển lên môi trƣờng đồng nuôi cấy. Sau 2 ngày đồng nuôi cấy các mẫu đƣợc nhuộm với X-Gluc ở 370C trong 8-12 giờ, sau đó đƣợc rửa với cồn 70% (v/v) để xác định biểu hiện của gen gus. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Kết quả đƣợc thể hiện trong bảng sau.
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của thời gian lây nhiễm đến khả năng biến nạp
Thời gian lây nhiễm
(phút)
Tổng số mẫu
Số mảnh cấy bắt màu xanh
khi nhuộm gus Giá trị trung bình Tỷ lệ % các mảnh bắt màu xanh Lần 1 Lần 2 Lần 3 10 100x3 16 19 20 18,33+4,33 18,33+4,33 20 100x3 42 45 41 42,67+4,33 42,67+4,33 30 100x3 30 31 27 29,33+4,33 29,33+4,33
Qua bảng trên cho thấy thời gian lây nhiễm ở 20 phút có hiệu quả chuyển gen cao hơn so với thời gian lây nhiễm 10 và 30 phút dựa trên số lƣợng các mảnh lá bắt màu xanh lam khi nhuộm với cơ chất X-gluc.
Qua biểu hiện tạm thời của gen gus trên các mô lá, kết quả cho thấy sự khác biệt là có ý nghĩa (α = 0,05) trong các khoảng thời gian lây nhiễm là 10 phút, 20 phút và 30 phút. Dựa vào kết quả trên chúng tôi chọn thời gian lây nhiễm 20 phút cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.1.2. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng biến nạp
Thời gian đồng nuôi cấy có ảnh hƣởng đến hiệu quả chuyển gen. Theo Rolando García González & CS (2008) nếu thời gian đồng nuôi cấy ít hơn 24 giờ tần số biến nạp và tái sinh thấp, có thể do thời gian ngắn tƣơng tác giữa mô thực vật và vi khuẩn không đủ. Theo Wahlroos &CS (2003) thời gian đồng nuôi cấy còn phụ thuộc vào từng loại thực vật. Để xác định thời gian đồng nuôi cấy tối ƣu, trong thí
37
nghiệm này chúng tôi tiến hành đồng nuôi cấy các mẫu sau khi lây nhiễm với thời gian lần lƣợt 2 ngày, 3 ngày, 4 ngày. Kết thúc thời gian đồng nuôi cấy các mẫu đƣợc nhuộm với X-Gluc ở 370
C trong 8-12 giờ, sau đó đƣợc rửa với cồn 70% (v/v) để xác định biểu hiện của gen gus. Kết quả thể hiện trong bảng sau.
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng biến nạp
Đồng nuôi
cấy (ngày) Tổng số mẫu
Số mảnh cấy bắt màu xanh
khi nhuộm gus Giá trị trung bình Tỷ lệ % các mảnh bắt màu xanh Lần 1 Lần 2 Lần 3 2 100x3 20 20 21 20,33+0,33 20,33+0,33 3 100x3 19 20 23 20,67+4,33 20,67+4,33 4 100x3 20 21 21 20,67+0,33 20,67+0,33
Qua bảng trên cho thấy khi thời gian đồng nuôi cấy tăng từ 2 đến 4 tỷ lệ các mẫu dƣơng tính khi nhuộm gus khác nhau không nhiều (từ 20,33% và 20,67%). Kết quả sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (α = 0,05) khi thay đổi thời gian đồng nuôi cấy 2; 3 và 4 ngày trong thí nghiệm.
Theo Wahlroos &CS (2003), thời gian đồng nuôi cấy phụ thuộc vào từng loại thực vật. Nhƣ trên táo Malus zumi (Matsumura) Rehd là 3 ngày [44]. R. Pratap Chandran và cộng sự (2011) lại tiến hành đồng nuôi cấy 2 ngày đối với khoai lang, khoai tây. Simon Deroles &CS (2002) cũng tiến hành đồng nuôi cấy 2 ngày trên cà rốt [72]. Vì vậy chúng tôi lựa chọn thời gian đồng nuôi cấy 2 ngày cho các thí nghiệm tiếp theo. Với thời gian đồng nuôi cấy 2 ngày tránh đƣợc sự phát triển trở lại của vi khuẩn có hại cho tế bào thực vật nhƣ gây hoại tử, mô không bị thấm ƣớt sẽ thuận lợi cho cấy chuyển. [76].
3.1.3. Ảnh hưởng của mật độ tế bào vi khuẩn đến khả năng biến nạp (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mật độ tế bào vi khuẩn có ảnh hƣởng đến hiệu quả trong biến nạp. Nếu mật độ tế bào vi khuẩn thấp khả năng tiếp xúc vi khuẩn với tế bào thực vật bị hạn chế.
38
Ngƣợc lại nếu mật độ quá cao khi nuôi cấy có sự cạnh tranh dinh dƣỡng giữa các tế bào, thời gian nuôi cấy dài làm vi khuẩn nhanh bị già làm giảm hiệu quả trong biến nạp. Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành xác định mật độ tế bào vi khuẩn thích hợp để sử dụng cho quá trình biến nạp vào khoai lang thông qua vi khuẩn A. rhizogens. Thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ sau.
Các mảnh lá đƣợc làm tổn thƣơng và ngâm với dịch huyền phù vi khuẩn có OD600 đƣợc pha loãng từ 0,5 đến 0,9 ở nhiệt độ phòng trong thời gian 20 phút. Kết thúc thời gian lây nhiễm mẫu đƣợc thấm khô bằng giấy thấm vô trùng và chuyển lên môi trƣờng đồng nuôi cấy. Sau 2 ngày đồng nuôi cấy các mẫu đƣợc nhuộm với X-Gluc ở 370C trong 8-12 giờ, sau đó đƣợc rửa với cồn 70% (v/v) để xác định biểu hiện của gen gus. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Kết quả thể hiện trong bảng sau.
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng mật độ tế bào vi khuẩn đến khả năng biến nạp
Mật độ tế bào vi khuẩn (OD) Tổng số mẫu Số mảnh cấy bắt màu
xanh khi nhuộm gus Giá trị trung bình Tỷ lệ % các mảnh bắt màu xanh Lần 1 Lần 2 Lần 3 0,5 100x3 14 13 14 13,67+0,33 13,67+0,33 0,6 100x3 17 19 22 19,33+6,33 19,33+6,33 0,7 100x3 29 30 32 30,33+2,33 30,33+2,33 0,8 100x3 36 35 38 36,33+2,33 36,33+2,33 0,9 100x3 22 20 25 22,33+6,33 22,33+6,33
Theo bảng trên cho thấy kết quả dƣơng tính khi nhuộm gus cao nhất đối với dịch huyền phù vi khuẩn có OD600 = 0,8 đạt 36,33%. Giá trị OD này nằm trong giới hạn của nhiều tác giả sử dụng biến nạp gen vào thực vật thông qua vi khuẩn
Agrobacterium. Luo H. R & CS (2008) biến nạp gen vào khoai tây bằng chủng A. tumefaciens EHA105 có OD từ 0,6 đến 0,8. Marceline Egnin& CS (1998) tiến hành biến nạp vào đậu với OD của Agrobacterium từ 0,6 đến 0,9. Gou-Qing Song & CS
39
(2004) lại sử dụng OD có giá trị từ 0,8 đến 1,0 để biến nạp vào khoai lang. Nhƣ vậy hiệu quả chuyển gen gus còn phụ thuộc vào chủng vi khuẩn cũng nhƣ loại thực vật đích [38], [52], [54]. Với α=0,05 kết quả cho thấy sự khác biệt trong hiệu quả biến nạp giữa các giá trị OD là có ý nghĩa. Chúng tôi sử dụng mật độ tế bào vi khuẩn có giá trị OD600 = 0,8 cho các nghiên cứu tiếp theo.
A B
Hình 3.1. Kết quả biến nạp A. rhizogens mang vector pPTN289/Gus
A. Mẫu lá âm tính B. Mẫu lá dƣơng tính (chuyển xanh do gen Gus)
3.1.4. Ảnh hưởng của chất cảm ứng (AS) đến khả năng biến nạp
AS là hợp chất của phenol, có tác dụng dẫn dụ, tăng cƣờng sự lây nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium, cảm ứng gen vir cần thiết cho việc chuyển T-DNA vào tế bào thực vật. Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hƣởng nồng độ chất cảm ứng AS đến khả năng biến nạp của Agrobacterium vào khoai lang. Thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ sau.
Dịch huyền phù vi khuẩn đƣợc pha loãng đến OD600 = 0,8 sau đó bổ sung thêm lần lƣợt 0µM; 100 µM; 150 µM; 200 µM AS vào dịch huyền phù vi khuẩn. Các mảnh lá làm tổn thƣơng đƣợc ngâm vào dịch huyền phù vi khuẩn trên trong thời gian 20 phút ở nhiệt độ phòng. Kết thúc thời gian lây nhiễm mẫu đƣợc thấm
40
khô bằng giấy thấm vô trùng và chuyển lên môi trƣờng đồng nuôi cấy. Sau 2 ngày đồng nuôi cấy chọn ngẫu nhiên 100 mảnh lá để nhuộm với X-Gluc ở 370
C trong 8- 12 giờ, sau đó đƣợc rửa với cồn để xác định biểu hiện của gen gus. Kết quả đƣợc thể hiện trong bảng sau.
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng nồng độ chất cẩm ứng AS đến khả năng biến nạp
Nồng độ AS (µM)
Tổng số mẫu
Số mảnh cấy bắt màu xanh
khi nhuộm gus Giá trị trung bình Tỷ lệ % các mảnh bắt màu xanh Lần 1 Lần 2 Lần 3 0 100x3 30 32 32 31+1,33 31+1,33 100 100x3 39 42 40 40,33+2,33 40,33+2,33 150 100x3 40 38 41 39,67+2,33 39,67+2,33 200 100x3 39 42 42 41,00+3,00 41,00+3,00
Kết quả bảng trên cho thấy khi bổ xung thêm AS vào biến nạp thì hiệu quả biến nạp tăng lên rõ rệt giữa mẫu đối chứng với các mẫu có sử dụng AS. Tuy nhiên giữa các mẫu có bổ xung AS thì sự khác nhau trong hiệu quả biến nạp là không nhiều (α=0,05). Vì vậy để giảm chi phí trong nghiên cứu chúng tôi lựa chọn bổ xung AS có nồng độ 100µM vào môi trƣờng biến nạp cho các thí nghiệm chuyển gen cry. Theo Rolando García González & CS (2008) các hợp chất phenolic tiết ra từ các mô thực vật bị tổn thƣơng và AS là những hợp chất quan trọng ảnh hƣởng đến biểu hiện của gen vir và tới hiệu quả chuyển T-DNA của Agrobacterium, bên cạnh đó ảnh hƣởng của AS tới hiệu quả chuyển gen còn phụ thuộc vào nhiệt độ, kiểu gen bị biến đổi. Nồng độ AS tối ƣu sử dụng trong biến nạp khoai lang xác định bởi Newell & CS (1995), Pineda & CS (2002) là 200µM. Otani & CS (1998) ở 50µM. Tuy nhiên, trái ngƣợc với kết quả của chúng tôi, Khanna và Raina (1999) cho rằng ở nồng độ 400-500μM AS sẽ làm tăng hiệu quả chuyển gen ở lúa gạo, nhƣng Jinjuan shen & CS (2012) lại sử dụng AS ở nồng độ 100 µM cho biến nạp ở
41
Japonica rice H02-117. Hơn nữa, AS không chỉ đƣợc sử dụng tăng hiệu quả biến nạp gen cho khoai lang mà còn đƣợc sử dụng trong lúa mì. Mc Cormac &CS (1998) sử dụng 100μM AS, trong khi đó Hamid Rashid &CS (2010) đã sử dụng 150μM AS để nâng cao hiệu quả chuyển gen của Triticum aestivum L. cv. Inqilab-91. Amoah &CS (2001) lại sử dụng AS ở nồng độ 200μM để tăng hiệu quả biến nạp ở lúa mì.
A B
Hình 3.2. Kết quả biến nạp A. rhizogens mang vector pPTN289/Gus (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
A. Rễ âm tính B. Rễ dƣơng tính (chuyển xanh do gen gus)
3.2. Kết quả chuyển gen cry3 vào khoai lang thông qua vi khuẩn A. rhizogens
Cry3 là gen mã hóa cho mã hóa protein hình thoi có trọng lƣợng 66-73 kDa, có tác dụng gây độc với ấu trùng thuộc bộ hai cánh. Sau khi thử nghiệm các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng biến nạp của A. rhizogens với khoai lang thông qua biểu hiện tạm thời của gen gus. Chúng tôi tiến hành biến nạp gen cry3 vào khoai lang với các điều kiện tối ƣu đã đƣợc xác định ở trên.
Giống khoai lang KB1 nuôi cấy invitro có tuổi từ 7 đến 13 ngày. Các mô lá đƣợc cắt thành các mảnh có kích thƣớc 1x1cm, cuống lá, chồi ngọn đƣợc cắt thành các đoạn có chiều dài 1cm. Các mô trên đƣợc ngâm với dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes mang vector pIBT/cry3 có OD600=0,8 bổ xung thêm 100µM AS, trong thời gian 20 phút ở nhiệt độ phòng. Kết thúc thời gian lây
42
nhiễm mẫu đƣợc thấm khô bằng giấy thấm vô trùng và chuyển lên môi trƣờng đồng nuôi cấy, đƣợc giữ trong tối ở nhiệt độ 26+20
C. Sau 2 ngày đồng nuôi cấy mẫu đƣợc chuyển sang môi trƣờng chọn lọc WPM có bổ sung kháng sinh cefotaxime 500 mg/L và kanamycine 50mg/L để loại bỏ vi khuẩn còn sót trên mẫu. Mẫu đƣợc nuôi dƣới ánh sáng trắng có cƣờng độ 2000lux với thời gian chiếu sáng 12giờ/ ngày
Sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trƣờng chọn lọc, lựa chọn các dòng rễ trắng, phân nhánh nhiều, đầu rễ không bị đen, sinh trƣởng tốt đƣợc cắt và chuyển sang nuôi lắc với tốc độ 80 vòng/phút trên môi trƣờng chọn lọc WPM lỏng có bổ sung cefotaxime 500mg/L và kanamycine 50mg/L. Sau 30-45 ngày nuôi cấy lỏng trong môi trƣờng chọn lọc, chọn lựa các dòng sinh khối rễ sinh trƣởng tốt mang đi tách, tinh sạch DNA tổng số và kiểm tra kết quả biến nạp bằng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu.
3.2.1. Sơ bộ đánh kết quả chuyển gen thông qua A. rhizogens mang vector pIBT/cry3 pIBT/cry3
Sau khi chuyển gen bằng vi khuẩn A. rhizogens, mẫu lá đƣợc đặt trên môi trƣờng chọn lọc WPM. Tỷ lệ chọn lọc sơ bộ của các mẫu trên môi trƣờng chọn lọc đƣợc thể hiện qua bảng.
Tỷ lệ cảm ứng tạo rễ của các mẫu trên môi trƣờng chọn lọc có cefotaxime 500 mg/L và kanamycine 50mg/L sau khi nhiễm với A. rhizogens và mẫu đối chứng
Thí nghiệm Tổng số mẫu Số mô sống sau 1 tuần Số mô sống sau 2 tuần Số mô sống sau 3 tuần Số mô sống sau 4 tuần Số mô cảm ứng tạo rễ Biến nạp 300 235 197 149 103 18 Đối chứng 50 0 0 0 0 0
Qua bảng trên, chúng tôi nhận thấy ở mẫu đối chứng các mẫu bị vàng và chết ở ngay tuần đầu tiên khi nuôi trên môi trƣờng chọn lọc. Ở mẫu biến nạp các mô sống sót trên môi trƣờng chọn lọc giảm dần theo thời gian, điều này cho thấy khả
43
năng những mẫu tồn tại và phát triển đƣợc là những mô mang các tế bào đã đƣợc chuyển gen. Tuy nhiên, chúng tôi cũng nhận thấy một số lƣợng lớn các mô sống sót và phát triển trên môi trƣờng chọn lọc nhƣng không cảm ứng tạo rễ. Các dòng rễ tơ này tiếp tục đƣợc chọn lọc trên môi trƣờng nuôi cấy lỏng tạo sinh khối để tách DNA và kiểm tra bằng phản ứng PCR.
44
A B
C D
Hình 3.4. Kết quả biến nạp gen cry3 vào khoai lang KB1
A. Mẫu lá đối chứng không biến nạp gen sau 2 tuần trên môi trƣờng WPM + cefotaxime 500 mg/L + kanamycine 50mg/L
B. Mẫu lá biến nạp A. rhizogens mang vector pIBT/cry3 sau 2 tuần trên môi trƣờng WPM + cefotaxime 500 mg/L + kanamycine 50mg/L
C. Mẫu rễ đối chứng không biến nạp gen sau 2 tuần nuôi lỏng trên môi trƣờng WPM + cefotaxime 500 mg/L + kanamycine 50mg/L
D. Mẫu rễ biến nạp A. rhizogens mang vector pIBT/cry3 sau 2 tuần nuôi lỏng trên môi trƣờng WPM + cefotaxime 500 mg/L + kanamycine 50mg/L
45
3.2.2. Kết quả tinh sạch DNA khoai lang tổng số
Các dòng sinh khối rễ sau khi nuôi lỏng 4 tuần để tiếp tục chọn lọc đƣợc rửa sạch, làm khô bằng máy hút chân không Savant. Các mẫu đƣợc sử dụng để tách và