3. Nội dung của đề tài
3.4. Kết quả kiểm tra hoạt lực diệt côn trùng của protein biến nạp
Sâu non và sâu trƣởng thành của bọ hà khoai lang đều gây hại, song chủ yếu là sâu non. Sâu non bọ hà vừa nở ra đục ngay vào phần thịt của củ tuy nhiên sâu mới nở thƣờng rất mềm yếu, kích thƣớc cơ thể nhỏ rất khó thao tác cho thí nghiệm. Để kết quả thí ngiệm đƣợc chính xác, thuận lợi trong nghiên cứu chúng tôi lựa chọn sâu non bọ hà tuổi 2 để tiến hành thử sâu hoạt lực của protein thu đƣợc, do sâu non bọ hà tuổi 2 có sức đục mạnh hơn, cơ thể dài khoảng 6-7mm, có mầu nâu nhạt dễ quan sát và thuận lợi cho thao tác cho thí nghiệm [11].
Protein thu đƣợc sau khi tách chiết, xác định hàm lƣợng đƣợc tiến hành thử hoạt tính diệt sâu non bọ hà tuổi 2. Các bƣớc tiến hành đƣợc thực hiện theo mục 2.5.3. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần, mỗi lần thử với 3 sâu non bọ hà tuổi 2. Cách 2 ngày kiểm tra kết quả một lần, sau 4 ngày bắt đầu xuất hiện sâu chết ở một số giếng. Sau 14 ngày kết quả thể hiện trong bảng sau.
Bảng 3.6. Hoạt lực diệt côn trung của protein lên sâu non bọ hà Dòng rễ tơ Protein (µg/giếng) Tổng số sâu thử Số sâu chết Tỷ lệ trung bình sâu chết (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 1 0 3x3 0 0 1 11,11+0,03 2 20 3x3 0 0 0 0,00+0,00 40 3x3 0 1 0 11,11+0,03 3 20 3x3 1 1 0 22,22+0,03 40 3x3 2 2 2 66,67+0,00
50
2: Mẫu có kết quả PCR âm tính với gen cry 3
3: Mẫu có kết quả PCR dƣơng tính với gen cry 3
Qua bảng trên cho thấy, với hàm lƣợng protein 20µg và 40µg/giếng tỷ lệ sâu chết ở mẫu 3 là tƣơng đối nhỏ. Theo nghiên cứu của Sheng-Jiun Wu &CS (2012) liều lƣợng gây chết ở LD50 của protein cry3A lên ấu trùng bọ cánh cứng
Tenebrio molitor là 11,4µg/ấu trùng. Ekobu & CS (2010) khi thử hoạt lực diệt sâu của protein Cry3Ca1 với các loại sâu của 2 loài Cylas puncticollis và Cylas brunneus có liều lƣợng chết trung bình (LC50) là 1µg/g thức ăn. Youngjin &CS (2009), hoạt lực diệt bọ cánh cứng của protein Cry3A, Cry3B có liều chết trung bình (LC50) trong khoảng 0,7- 13,0µg/cm2. Trong khi theo Selvapandiyan & cs (2001) khi thử hoạt lực diệt sâu của protein vip3V với các loại sâu khác nhau thuộc Bộ Cánh vảy có liều lƣợng chết trung bình dao động trong khoảng từ 5-2000 ng/cm2. Tuy nhiên điều này có thể do protein chiết trong thí nghiệm chƣa đƣợc tinh sạch, tách riêng protein độc, protein sử dụng dƣới dạng protein thô. Cũng có thể do sâu ăn ít thức ăn nên lƣợng độc tố chƣa đủ làm chết sâu.
Trong thực tế nghiên cứu, tỷ lệ của sâu non chết ít, không đồng đều khi tiến hành thử nghiệm cùng một nồng độ độc tố còn phụ thuộc nhiều vào cách bố trí, thao tác thí nghiệm, môi trƣờng nuôi sâu và chất lƣợng sâu non đem thử. Theo một số nghiên cứu của Cao-guo & CS (1997), Selvapandiyan và CS (2001), khi tiến hành thí nghiệm thử protein độc với sâu xám (Agrotis ypsilon) các tác giả đã xác định trọng lƣợng của sâu trƣớc và sau khi thí nghiệm với kích thƣớc sâu non ban đầu là 30-40mm. Tuy nhiên trong thí nghiệm ở đây, do sâu non bọ hà tuổi 2 rất nhỏ kích thƣớc cơ thể dài khoảng 6-7mm nên việc thao tác gặp nhiều khó khăn, vì vậy chúng tôi chỉ quan sát sự phát triển của sâu non bằng hình thái bên ngoài. Do vậy dựa theo kết quả (bảng 3.6) chúng tôi tạm kết luận protein tách từ dòng khoai lang dƣơng tính với gen cry3 có hoạt tính độc đối với sâu non bọ hà.
51 Sâu non ở mẫu đối chứng (trái) và mẫu 2
(phải) (dòng rễ tơ âm tính với gen cry3)
Sâu non chết ở mẫu 3 (dòng rễ tơ dƣơng tính với gen cry3)
52
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết Luận
- Xác định đƣợc điều kiện thích hợp cho quá trình chuyển gen tạo rễ tơ vào khoai lang KB1 thông qua vi khuẩn A. rhizogens sử dụng vector chuyển gen pPTN289 mang gen chỉ thị gus.
Thời gian biến nạp: 20 phút Thời gian đồng nuôi cấy: 2 ngày
Nồng độ chất cảm ứng AS bổ xung vào huyền phù vi khuẩn: 100µM OD huyền phù vi khuẩn: 0,8
- Bƣớc đầu đã thu nhận đƣợc 01 dòng khoai lang KB1 mang gen cry3
kháng bọ hà.
- Bƣớc đầu đã xác định đƣợc protein tạo thành từ dòng khoai lang chuyển gen cry3 có hoạt tính độc đối với sâu non bọ hà tuổi 2.
Kiến nghị
Để tiếp tục phát triển các kết quả nghiên cứu, chúng tôi đề xuất kiến nghị nhƣ sau:
- Tiếp tục tách, tinh sạch và định lƣợng protein cry3 đƣợc mã hóa bởi gen
cry3 trong các dòng rễ tơ chuyển gen
- Tiến hành thử protein cry3 đã đƣợc tinh sạch lên sâu non bọ hà để đánh giá hiệu quả diệt sâu non bọ hà một cách chính xác.
- Tiếp tục tạo các dòng rễ tơ chuyển gen từ các giống khoai lang khác, sử dụng các cấu trúc gen khác nhau và đánh giá hoạt động các gen đƣợc chuyển, để hoàn thiện phƣơng pháp chuyển gen vào khoai lang.
53
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
2. Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trƣơng Nam Hải, Lê Quang Huấn (2003), Áp dụng các kĩ thuật phân tử trong nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
3. Phan Văn Chi (2003), ―Khối phổ trong nghiên cứu proteomics‖, Tạp chí Công
nghệ Sinh học, 1(1), tr. 11-24.
4. Nguyễn Hoài Hƣơng, Bùi Thế Vinh (2009), Thực hành hóa sinh, Đại học Quốc Gia, TPHCM.
5. Bùi Thị Hƣơng (2002), Phân lập và phân loại và xác định tính chất sinh hoá và sinh học phân tử của một số chúng Bacillus thuringiensis ở Việt Nam, Luận văn Thạc sĩ sinh học, tr. 1-4.
6. Lê Thị Thu Hiền (2003), Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen kháng côn trùng để chuyển vào cây trồng, Luận văn Tiến sĩ Sinh học, tr. 22-28; 33-36.
7. Bùi Bảo Hoàn (1993), Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào trong bảo quản nhân giống và chọn dòng chịu lạnh ở khoai lang (Ipomea batatas L.), Luận văn Thạc sĩ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà nội.
8. Trần Thị Lệ, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Quốc Dung (2007), Công nghệ gen trong nông nghiệp, Nhà xuất bản nông nghiệp, Hà Nội.
9. Đinh Thế Lộc (1977), Kỹ thuật canh tác cây khoai lang, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 5-13.
10. Ngô Xuân Mạnh (1996), Nghiên cứu các chỉ tiêu phẩm chất và một số biện pháp chế biến nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng khoai lang trồng vụ đông ở miền Bắc Việt Nam, Luận án phó Tiến sỹ khoa học nông nghiệp, Trƣờng Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội.
11. Nguyễn Trung Nam, Vũ Đình Hoà, Đinh Sơn Quang, Nguyễn Thị Bích Thuỷ, Võ Thị Thứ, Lê Trần Bình (2001), ―Sàng lọc các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis phục vụ cho việc phân lập gen kháng bọ hà ở khoai lang‖, Kỷ yếu Viện Công nghệ Sinh học, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr.206-213.
54
12. Trịnh Xuân Ngọ, Đinh Thế Lộc (2005), Cây có củ và kỹ thuật thâm canh, Nhà xuất bản Lao động xã hội, Hà Nội. Tập 1.
13. Phạm Bích Ngọc, Đinh Thị Phòng, Egnin M., Prakash C.S., Lê Trần Bình (2002), ―Hoàn thiện phƣơng pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens‖, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 40, tr. 142-149.
14. Lâm Đại Nhân (2000), Tách dòng và thiết kế vector chuyển gen của gen mã hoá protein vỏ (coat protein) từ virus gây bệnh đốm vòng cây đu đủ (PRSV) ở Việt Nam, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, tr 35-36.
15. Nguyễn thị Kim Oanh, Elske Van de Fliert, Ann R. Braun (2001), Quản lý dịch hại tổng hợp cây khoai lang, Trung tâm Khoai tây quốc tế, tr. 106-113.
16. Nguyễn Công Tạn (2012), Vị thế mới của cây khoai lang trong nền nông nghiệp, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.
17. Lê Thị Bích Thảo (2003), Nghiên cứu biểu hiện và tinh chế protein lai HSP2, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, tr 35-36.
18. Nguyễn Văn Toản, Nguyễn Văn Đĩnh và Nguyễn Bích Thuỷ (1997), ―Kết quả bƣớc đầu sử dụng vật liệu ngăn ngừa bọ hà (Cylas farmicarius) trong bảo quản khoai lang tƣơi‖, Tạp chí BVTV, 1, tr. 26-28.
19. Nguyễn Thị Bích Thuỷ (1997), Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của bọ hà (Cylas formicarius fabricius) và biện pháp phòng chống chúng trong thời kỳ bao quản khoai lang tươi, Luận văn Thạc sĩ khoa học nông nghiệp, tr. 40-42; 54-59; 80-83.
20. Nguyễn Văn Uyển (1995), Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật,
Nhà xuất bản Nông nghiệp thành phố Hồ Chí Minh. Tập 1.
Tài liệu tiếng Anh
21. Amoah, B.K., H. Wu, C. Sparks and H.D. Jones (2001) ―Factors influencing
Agrobacterium-mediated transient expression of uidA in wheat inflorescence tissue‖, Journal of Experimental Botany, 52(358), pp.1135-1142.
22. Bo Yu. Hong Zhai. Yuping Wang. Ning Zang. Shaozhen He. Qingchang Liu (2007), ―Efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation using embryogenic suspension cultures in sweetpotato, Ipomoea batatas (L.) Lam.‖,
Plant Cell Tiss Organ Cult, 90, pp. 265–273.
23. Briew L. O., Henrry R. J. (2000), Transgenic Cereal, American Association of Cereal Chemist St. Paul, Minnesota, USA, pp. 649-656.
55
24. Cannon R. J. C. (1997) ―Bacillus thuringiensis use in agriculture: A molecular perspective‖, Biol. Rev., 71, pp. 561-636.
25. Cao-guo Y., Martha A. M., Gregory W. W., Micheal G. K. and Juan J. E. (1997), ―The Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein Vip3A lyses midgut epithelium cells of susceptible insects‖, Appl. Environ. Microbiol, 63, pp. 532-536.
26. Carozzi, N. B., V. C. Kramer, G.W.Warren, S.Evola, and M.G. Koziel (1991),
“Prediction of insecticidal activity of Bacillus thuringiensis strains by
polymerase chain reaction product profile‖, Appl. Environ. Microbiol, 57, pp.
3057-3061.
27. De Maagd R., H. Van Der Klei, P. L. Bakker, W. J. Stiekema, and D. Bosch (1996) ―Different domains of Bacillus thuringiensis δ-endotoxins can bind to insect midgut membrane protens on ligand blots.‖, Appl. Environ. Microbiol,
62, pp. 2753-2757.
28. De Maagd R.A., A. Bravo, and N. Crickmore (2001) ―How Bacillus thuringiensis has evolved specific toxins to colonize the insect world.‖, Trends in Genetic, 17, pp. 193-200.
29. Dix P. J. (1986), Plant Cell Culture Technology, Yeoman M.M, Oxford, Blackwell Scientific Publication, pp.143-201.
30. Drake, P.M.W., D.M. Chargelegue, N.D. Vine, C.J. van Dolleweerd, P. Obregon, and J.K.C. Ma (2003), ―Rhizosecretion of a monoclonal antibody protein complex from transgenic tobacco roots‖, Plant Molecular Biology, 52(1): p. 233-241.
31. Ekobu M, Solera M, Kyamanywa S, Mwanga RO, Odongo B, Ghislain M, Moar WJ (2010), ―Toxicity of seven Bacillus thuringiensis Cry proteins against Cylas puncticollis and Cylas brunneus (Coleoptera: Brentidae) using a novel artificial diet‖, J Econ Entomol, 103(4), pp. 1493-502.
32. FAOSTAT (1998), FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations) Statistics Database (Online). Accessed June 1999. Available http://apps.fao.org.
33. Francis R. and Donald H. D (1996), Report on Molecular of Bacillus thuringiensis, Bacillus thuringiensis conferences in Thailand, pp. 2-3; 8-13.
56
34. Gawel N.J and Jarret R.L (1991), ―A modified CTAB DNA extraction procedure for Musa and Ipomoea‖ Plant Molecular Biology Reporter, 9, pp. 262-266.
35. Gill S. S., E. A Cowles, and P. V. Pietranto (1992), ―The mode of action of
Bacillus thuringiensis endotoxins‖, Annu. Rev. Entomol., 37, pp. 615-636. 36. Grachulski P., L. Masson, S. Borisova, M. Puzstai-Carey, J.-L. Schwartz, R.
Brousseau, and M. Cygler (1995), ―Bacillus thuringiensis CryIA(a) insecticidal toxin: crystal structure and channel formation‖, J. Mol. Biol., 254, pp. 447-464.
37. Gregory C. Philips, John F. Hubstenberger, and Elizabeth E. Hansen. (1995), ―Plant regeneration from callus and cell suspension cultures by somatic embryogenesis‖, Plant Cell, Tissue and Organ Culture. Springer, pp. 80-82. 38. Guo-Qing Song, Hideo Honda, and Ken-Ichi Yamaguchi (2004), ―Efficient
Agrobacterrium tumefaciens-mediated transformation of Sweet potato (Ipomoea batatas (L.) Lam) from stem explants using a two-step kanamycin- hygromycin selection method‖, In Vitro Cell. Dev. Biol.Plant, 40, pp. 359–365 39. Hamid Rashid, Asma Afzal, M. Haroon Khan, Zubeda Chaudhry and Salman A. Malik (2010), ―Effect of bacterial culture density and acetosyringone concentration on Agrobacterium-mediate transformation in wheat‖ Pak. J. Bot., 42(6), pp. 4183-4189.
40. Hai-Kun Liu. Chao Yang. Zhi-Ming Wei (2004), ―Efficient Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of soybeans using an embryonic tip regeneration system‖, Planta, 219, pp.1042–1049.
41. Höfte H., and H. R. Whiteley (1989), ―Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis‖, Microbiological Reviews, 53, pp. 242-255.
42. Jansson, R. K. Raman,K.V. (1991), Sweetpotato pest management, West view press. India.
43. Jefferson R.A. (1987) ―Gus fusions: -glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants‖. EMBO J, 16, pp. 2901-2907.
44. Jin Xu, Yu Zhen Wang, Heng Xia Yin and Xiao Jing Liu (2009), ―Efficient
Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Malus zumi
(Matsumura) Rehd using leaf explant regeneration system‖, Electronic Journal of Biotechnology, 12(1), pp. 3-7.
57
45. Jinjuan Shen, Pingzhong Cai, Feng Qing, Zhiyong Zhang, and Gũiue Wang (2012), ―A primary study of high performance transgenic rice through maize UBI-1 promoter fusing selective maker gene‖, Pak. J. Bot, 44(2), pp. 501-506. 46. Juan J. Estruch. Gregory W. Warren, Martha A. Mullins, Gordon J. Nye, Joyce
A. Craig and Michael G. Koziel. (1996), ―Vip3A, a novel Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein with a wide spectrum of activities against lepidopteran insects‖, Proc. Natl. Acad. Sci, 93, pp. 5389-5394.
47. Li J., J. Carroll, and D. J. Ellar (1991), ―Crystal structure of insecticidal δ- endotoxin from Bacillus thuringiensis at 2.5A0 resolution‖, Nature, 353, pp. 81-821.
48. Li J., P. A. Koni, and D. J. Ellar (1996), ―Structure of the mosquitocidal δ- endotoxin cyt B from Bacillus thuringiensis.”, Journal of Moleculer Biology,
257, pp. 129-152.
49. Liu J. R. and Cantliffe D. J. (1984), ―Somatic embryogenic and plant regeneration in tissue cultures of sweetpotato (Ipomoea batatas Poir.)‖, Plant Cell Reports, 3, pp. 112-115.
50. Loguercio L. L., Barreto M. L., Rocha T. L., Santos C. G. and Paiva E. (2002),
―Combined analysis of supernatant-based feeding bioassays and PCR as a
first-tier screening strategy for Vip-derived activities in Bacillus thuringiensis
strains effective against tropical fall armyworm‖, Jounal of Applied Microbiology, 93, pp. 269-277.
51. Lucckmini K. W. (1994), ―Plant regeneration of sweetpotato (Ipomoea batatas
Poir.)‖, Plant Cell Reports, 3, pp.112-115.
52. Luo H. R, Santa Maria M, Benavides J, Zhang D. P, Zhang Y. Z and Ghislain M. (2006), ―Rapid genetic transformation of sweetpotato (Ipomoea batatas
(L.) Lam) via organogenesis‖, African Journal of Biotechnology, 5(20), pp. 1851-1857.
53. Marfalane R., Jackson G. V (1989), Cylas formicarius, Sweetpotato weevil, Published by the Pacific Commission, BPDC noumea cedex, new caledonia, pp.1-4.
54. Marceline Egnin, Adalgisa Mora, and Channapatna S. Prakash (1998), ―Factors enhancing Agrobacterium tumefaciens - Mediated gene transfer in Peanut
(Arachish ypogaea L.)‖, In Vitro Cellular & Developmental Biology. Plant, 34 (4), pp. 310-318.
58
55. McCormac, A.C., H. Wu, M. Bao, Y. Wang, R. Xu., M.C. Elliott and Chen Dong-Fang (1998), ―The use of visual marker genes as cell specific reporters of Agrobacterium-mediated TDNA delivery to wheat (Triticum aestivum L.) and barley (Hordeum vulgare L.)‖, J.Euphytica, 99, pp. 17-25.
56. Mohamed A Ibrahim, Natalya Griko, Matthew Junker, and Lee A Bulla (2010), ―Bacillus thuringiensis‖, Bioeng Bugs, 1(1), pp. 31–50.
57. Merkli A, Christen P, and Kapetanidis I (1997), ―Production of diosgenin by hairy root cultures of Trigonella foenum-graecum L.‖ Plant Cell Reports
16(9), pp. 632-636.
58. Moran R., Garcia R., Lopez A., Zaldua Z., Mena J., Garcia M., Armas R., Somonte D. and Pimentel E. (1998), "Transgenic sweetpotato plants carrying delta-endotoxin gene from Bacillus thuringiensis var. tenebrionis". Plant Science 139, pp. 175-184
59. Newel, C.A., Lowe, J.M., Merryweather, A., Rooke, L.M. and Hamilton, W.D.O. (1995), ―Transformation of sweet potato (Ipomoea batatas Lam.) with
Agrobacterium tumefaciens and regeneration of plants expressing cowpea trypsin inhibitor and snowdrop lectin‖ Plant Science, 107, pp. 215-227.
60. Nina Sevón, Kirsi Marja Oksman Caldentey (2002), ―Agrobacterium rhizogenes
- Mediated transformation: Root cultures as a source alkaloids‖, Planta Med, 68, pp. 859-868.
61. Otani, M., Mii, M., Handa, T., Kamada, A. and Shimada, T (1993), ―Transformation of sweet potato (Ipomoea batatas (L) Lam) plants by
Agrobacterium rhizogenes”, Plant Science, 94, pp. 151- 159.
62. Pineda CR, Toro PN, Narvaez J, Orozco Cardenas ML, Laignelet A, Cárdenas H (2002), ―Genetic transformation by Agrobacterium tumefaciens of embryogenic cell suspensions of plantain "dominico Harton" (Musa AAB Simmonds)‖, Informusa, 11, pp. 9-13.
63. Prakash C. S., Varadarajan U. (1992), Genetic transformation of sweetpotato. Sweetpotato Technology for the 21st century, Tuskegee University, pp. 27-37. 64. Prakash CS, Varadarajan U (1992), ―Genetic transformation of sweetpotato by
particle bombardment‖, Plant Cell Rep, 11, pp. 53-57.
65. R Pratap Chandran and V P Potty (2008), ―Induction of hairy roots through the mediation of four strains of Agrobacterium rhizogenes on five host plants‖,
59
66. Rolando García González, Danalay Somonte Sánchez, Zurima Zaldúa Guerra, Jesús Mena Campos, Alina López Quesada, Rolando Morán Valdivia, Ariel D.
