3. Nội dung của đề tài
3.2.3.Kết quả chuyển gen cry3 vào khoai lang thông qua A rhizogens
Để đánh giá hiệu quả biến nạp vào khoai lang, ngoài đặc điểm hình thái rễ tơ thì việc kiểm tra sự hiện diện các gen đích trong các dòng rễ tơ bằng phản ứng PCR là cần thiết để đánh giá chính xác.
DNA sau khi tinh sạch đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR để kiểm tra sự hiện diện của gen cry3 trong rễ cây khoai lang với cặp mồi đặc hiệu.
46
Sản phẩm sau phản ứng PCR đƣợc điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả PCR đƣợc thể hiện ở hình 3.5.
+ - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M
Hình 3.6. Điện di sản phẩm PCR các dòng rễ khoai lang với cặp mồi cry3
M: Thang chuẩn DNA 1kb
(-): Đối chứng âm với đệm TE 1X
(+): Đối chứng dƣơng sử dụng vector pIBT/cry3 1-12: Các dòng rễ khoai lang.
Qua hình 3.5 cho thấy, trong 12 dòng khoai lang thí nghiệm chỉ có 2 dòng cho kết quả dƣơng tính (mẫu 8 và 9), xuất hiện một băng vạch có cùng kích thƣớc với đối chứng dƣơng cho thấy sự có mặt của gen cry3. Các dòng còn lại đều cho kết quả âm tính.
Các gen vir có vai trò quan trọng trong quá trình lây nhiễm và chuyển gen ở vi khuẩn Agrobacterium vào thực vật. Biểu hiện của gen vir trong các mô thực vật chỉ thị cho sự hiện diện hay không của vi khuẩn Agrobacterium trong các mô sau biến nạp [65].
Để khẳng định kết quả biến nạp gen cry3 thành công vào khoai lang, cùng với kiểm tra sự hiện diện của gen cry3, chúng tôi đồng thời tiến hành kiểm tra sự hiện diện của gen vir trong 12 dòng rễ tơ bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc 941bp
1000bp 750bp
47
hiệu, để xác định sự có mặt của plasmid hoặc vi khuẩn A. rhizogens còn nhiễm trong các mô, trong môi trƣờng nuôi cấy. Kết quả phản ứng PCR với cặp mồi virC đƣợc thể hiện ở hình 3.6.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 - +
Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR các dòng rễ khoai lang với cặp mồi virC
M: Thang chuẩn DNA 1kb
(-): Đối chứng âm với đệm TE 1X
(+): Đối chứng dƣơng với vi khuẩn A. rhizogens
1-12: Các dòng rễ khoai lang.
Qua kết quả thu đƣợc ở trên, cho thấy: trong 12 dòng rễ tơ đƣợc kiểm tra sự hiện diện của gen vir bằng phản ứng PCR chỉ có có 01 mẫu (mẫu 8) cho kết quả dƣơng tính. Nhƣ vậy dòng rễ tơ số 8 vẫn còn sự hiện diện của vi khuẩn A. rhizogens trong mô sau biến nạp.
Từ hình 3.6 và 3.7 cho thấy chúng tôi đã biến nạp thành công gen cry3
vào 01 dòng khoai lang KB1 (mẫu 9). Đây chính là cơ sở, nguồn nguyên liệu phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
~700bp 750bp
48