3. Nội dung của đề tài
1.4.3. Cấu trúc và cơ chế tác động của protein cry gây độc cho côn trùng
Tinh thể độc có thể chiếm đến trên 25% trọng lƣợng khô của tế bào có bản chất là protein, đƣợc tổng hợp trong pha cân bằng của Bt. Khi nhuộm xanh metylen hoặc fusin đỏ thì độc tố bắt màu dƣới kính hiển vi đối pha tinh thể độc, chúng bền với nhiệt nhƣng lại bị mất hoạt tính khi bảo quản lâu, tiếp xúc với focmandehit 20% hay tia tử ngoại do tinh thể độc bị biến dạng hoặc bị phân hủy.
Hình 1.7. Cấu trúc của độc tố Cry 3A
(nguồn: http:// www.bioc.cam.ac.uk/UTOs/Ellar.html)
Cấu trúc không gian 3 chiều của 4 loại - endotoxin (Cry 1, Cry 2, Cry 3 và Cyt 2A) đƣợc ngiên cứu bằng kỹ thuật chiếu xạ tia X [36], [47], [48]. Protein Cry 1, Cry 2, và Cry 3 có cấu trúc tƣơng tự nhau, mỗi loại đều bao gồm 3 vùng chính.
24
Vùng I là đầu N, gồm 7 chuỗi xoắn α. Trong đó 6 chuỗi xắn ngoài bao gồm vùng ƣa nƣớc và kỵ nƣớc quấn quanh một chuỗi xoắn trung tâm. Vùng II bao gồm 3 phiến gấp đƣợc lặp lại 3 lần, có tính đối xứng, cấu trúc nhƣ vậy của vùng II đƣợc gọi là cấu trúc ―Greek Key‖. Vùng III là đầu C của chuỗi polipeptid gồm 2 phiến gấp
song song nối với nhau bởi đoạn peptid vòng ngắn. Mỗi vùng có có vai trò quan trọng trong hoạt tính độc tố. Vùng I có vai trò chèn vào màng tế bào và hình thành lỗ hổng. Hai vùng II và III nhận biết các thụ thể đặc hiệu. Ngoài ra vùng III cũng tham gia vào tạo ra các lỗ hổng trên màng tế bào [37], [28].
Các protein độc của Bt hoạt động có chung một cơ chế tác động gây độc chung với côn trùng gồm 3 bƣớc chính [6], [24], [ 33], [35], [41].
Sau khi côn trùng ăn phải các tinh thể độc (tiền độc tố), các tinh thể độc đƣợc hòa tan ở ruột giữa côn trùng do ở đây có pH kiềm (pH 10-12), tạo thành các chuỗi protein tiền độc tố có trọng lƣợng 130-135kDa, dƣới tác động của môi trƣờng có pH>10 và sự hoạt động của enzym protease ở ruột giữa của ấu trùng phân giải tiền độc tố tạo ra protein dạng hoạt hoá có kích thƣớc khoảng 55-75 kDa.
Độc tố sau khi đƣợc hoạt hoá gắn với các phân tử thụ thể đặc hiệu trên màng các tế bào biểu bì ruột giữa côn trùng.
Sau khi gắn kết, độc tố chèn vào màng tế bào và làm thay đổi gradient điện hoá do tạo ra các lỗ và các kênh chọn lọc và không chọn lọc. Điều này dẫn đến sự phá huỷ cân bằng áp suất thẩm thấu trong và ngoài màng tế bào, là nguyên nhân làm tế bào trƣơng và bị vỡ, làm cho côn trùng không tiêu hoá đƣợc thức ăn dẫn đến chết. Sự chết của côn trùng diễn ra nhanh chóng, xác chết đã cung cấp dinh dƣỡng cho sự sinh trƣởng của Bacillus thuringiensis từ những bào tử.
25
Hình 1.8. Mô hình hoạt động của protein Cry gây độc đối với côn trùng [56]