Một số thành tựu tạo cây khoai lang chuyển gen

3. Nội dung của đề tài

1.4.4. Một số thành tựu tạo cây khoai lang chuyển gen

Cũng nhƣ các cây lƣơng thực khác, các phƣơng pháp tạo cây khoai lang chuyển gen đã đƣợc tiến hành nghiên cứu từ những năm 1987. Đã có rất nhiều các nghiên cứu nhằm tăng cƣờng khả năng tái sinh cây khoai lang in vitro [51], [49], và các nghiên cứu hệ thống chuyển gen sử dụng vector chỉ thị bằng phƣơng pháp bắn gen [65]. Hay thông qua Agrobacterium để chuyển gen [83]. Song song với các nghiên cứu hệ thống tái sinh cây và chuyển gen là nghiên cứu phân lập các gen kháng côn trùng cry, vip, gen mã hoá lectin, gen dự trữ protein ở củ, các gen tăng cƣờng hàm lƣợng axit amin cần thiết asp1, gen kháng virus SPMFV... và các promoter liên quan [82]. Gần đây, một số công trình nghiên cứu đã công bố về tạo cây khoai lang chuyển gen có ích nhƣ gen

26

cry kháng côn trùng; gen mã hoá chất ức chế proteinase, kháng virus thông qua hệ thống chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium [58].

Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về hệ thống tái sinh và hệ thống chuyển gen vào cây khoai lang sử dụng vector mang gen chỉ thị để nhằm mục đích hoàn thiện qui trình chuyển gen làm cơ sở cho bƣớc chuyển gen có giá trị sau này [6], [7], [13].

27

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị

2.1.1. Vật liệu a. Thực vật: a. Thực vật:

Thực vật đƣợc sử dụng trong nghiên cứu là các mảnh lá, đoạn thân và chồi giống khoai lang KB1 thu thập từ Viện khoa học nông nghiệp Việt Nam, nuôi cấy trong điều kiện in vitro. Giống khoai lang này đang đƣợc giữ tại phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

b. Chủng vi khuẩn:

- Chủng Agrobacterium rhizogenes ATCC15834/PTN289 (Viện Sinh học phân tử và Dƣợc học, Trƣờng Đại học Heidelberg, CHLB Đức)

- Chủng Agrobacterium rhizogenes pIBT/cry3

2.1.2. Hóa chất

Các môi trường nuôi cấy:

- Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn: YMP - Môi trƣờng nuôi cấy thực vật MS

- Môi trƣờng đồng nuôi cấy và cảm ứng tạo rễ tơ: WPM

Các loại kháng sinh: Kanamycine, Cefotaxime, Spectinomycine.

Các hóa chất thông dụng trong sinh học phân tử (thang marker chuẩn, agarose, phenol, chloroform, isoamylalcholhol... ) thuộc phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học mua từ các hãng nổi tiếng nhƣ Invitrogen, Merk, Amersham Parmacia Biotech, Fermentas, New England Biolabs...

2.1.3. Thiết bị

Các thiết bị dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật: box cấy vô trùng, bình nuôi cây, nồi khử trùng, bể ổn nhiệt, máy nuôi lắc, máy đo pH. Kính hiển vi điện tử soi nổi (Olympus SZX ILLK 100, Japan)…

28

Một số thiết bị dùng trong sinh học phân tử: máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di PowerPac 300 (Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh, máy soi gel, máy ly tâm, máy hút chân không, máy đo OD, máy vortex .., cùng với các trang thiết bị khác của phòng Công nghệ tế bào thực vật và Phòng thí nghiệm trọng điểm gen, Viện Công nghệ sinh học.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Chuyển gen thông qua Agrobacterium

2.2.1.1. Tạo dịch huyền phù Agrobacterium

Cấy trải Agrobacterium cất giữ trong glyxerol lên đĩa môi trƣờng YEP thạch có bổ sung spectinomycine 50 mg/L, nuôi ở 280

C trong 36-48 giờ. Sau đó lấy một khuẩn lạc vi khuẩn nuôi trong 5ml môi trƣờng YEP lỏng có bổ sung 50mg/L spectinomycine nuôi ở nhiệt độ 280C, sau 8 giờ, chuyển toàn bộ 5ml dịch nuôi cấy trên sang 45ml môi trƣờng YMP lỏng có bổ sung 50mg/L spectinomycine nuôi lắc 220 vòng/phút ở nhiệt độ 280C, sau 16-18 giờ lấy dịch huyền phù vi khuẩn nuôi cấy trên ly tâm với tốc độ 6000-6500 vòng/ phút, ở 40

C trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi và hoà tan cặn với môi trƣờng 1/2 MS (pH=5,8) và pha loãng cho tới OD600  0.5- 0.9. Dịch huyền phù vi khuẩn này có thể đƣợc sử dụng để biến nạp ngay hay có thể giữ ở 40

C trong 1-2 giờ.

2.2.1.2. Nhiễm vi khuẩn với mảnh lá

Lá bánh tẻ và đoạn thân của các cây khoai lang nuôi cấy in vitro đƣợc cắt thành những mảnh nhỏ có kích thƣớc 1cm2. Những mảnh lá, cuống lá và các chồi này sau đó đƣợc ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn khoảng 10-30 phút ở nhiệt độ phòng sau đó đƣợc đặt lên môi trƣờng WPM nuôi trong tối 48 giờ, ở nhiệt độ 260

C

 20C.

Sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trƣờng cảm ứng các mảnh lá đƣợc chuyển sang môi trƣờng chọn lọc.

29

2.2.2. Đánh giá cây trồng chuyển gen qua biểu hiện tạm thời của gen gus.

Thƣờng sử dụng dung dịch muối 5-Br-4-Cl-3-indolyl β-D-glucuronide cyclohexylamine (X-Gluc) để nhuộm mô tế bào [11], [20]. Sản phẩm sơ cấp 5-Br-4- Cl-3indolyl vẫn còn là một chất dễ tan, không màu. Nhƣng ngay sau đó sản phẩm này bị ôxy hóa và dimmer hóa thành một phức hệ không tan có màu xanh. Sự có mặt của ferri và ferrocyanide trong dung dịch nhuộm làm tăng quá trình hình thành sản phẩm cuối cùng, đồng thời cũng góp phần hạn chế việc khuếch tán sản phẩm sơ cấp đến vùng không có gus [3].

Các bộ phận khác nhau của cây chuyển gen đƣợc ngâm trong dung dịch đệm cơ chất X-Gluc. Sau 24-48 giờ mẫu nhuộm đƣợc tẩy hết diệp lục bằng Ethanol 70% và quan sát trên kính lúp soi nổi. Biểu hiện hoạt động của gen gus sau khi chuyển vào tế bào thực vật là phản ứng tạo màu đặc trƣng trên các tế bào, mô, bộ phận của cây chuyển gen.

Nhuộm gus đƣợc thực hiện trong thí nghiệm xác định biểu hiện tạm thời, mô sẹo, chồi mầm và rễ mới tái sinh. Nhuộm gus cũng để khẳng định gen chuyển đƣợc di truyền sang thế hệ sau khi nhuộm phôi của hạt hình thành từ cây chyển gen.

2.2.3. Tách, tinh sạch DNA tổng số

Các mảnh lá, cuống lá, chồi đƣợc nuôi trên môi trƣờng chọn lọc, sau 30 ngày lựa chọn các dòng rễ trắng, đầu rễ không bị thâm đen, sinh trƣởng tốt để chuyển sang nuôi cấy lỏng trên môi trƣờng WPM lỏng có bổ sung kháng sinh Cefotaxime, rễ đƣợc nuôi lắc 80 vòng/phút ở nhiệt độ 260

C. Sau 30-45 ngày mang đi tách và tinh sạch DNA tổng số.

Các mẫu sinh khối rễ đƣợc tách và tinh sạch DNA tổng số theo phƣơng pháp của Gawel và Jarret (1991).

2.2.4. Kiểm tra gen biến nạp bằng kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR do Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Từ đó đến nay kỹ thuật này đƣợc sử dụng rất phổ biến trong công nghệ sinh học và đã góp phần to lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử.

30

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction - phản ứng chuỗi polymerase) dựa trên nguyên tắc bắt cặp đặc hiệu của các đoạn DNA có trình tự bổ sung, của các nucleotid tự do với DNA khuôn, và phản ứng kéo dài đoạn trình tự mồi nhờ enzym Taq DNA polymerase để khuếch đại theo hàm mũ các đoạn DNA quan tâm lên hàng triệu lần.

Các dòng sinh khối rễ sau khi tách DNA đƣợc kiểm tra bằng kỹ thuật PCR với các cặp mồi cry3, virC để kiểm tra và khẳng định sự hiện diện của gen cry3 trong các dòng rễ biến nap. Phản ứng PCR đƣợc tiến hành với các thành phần đƣợc trình bày trong bảng 2.1 và chu kỳ nhiệt trong bảng 2.2. Trong đó, nhiệt độ gắn mồi đƣợc xác định dựa trên nhiệt độ bắt mồi của cặp mồi đã đƣợc thiết kế.

Trình tự các cặp mồi cry3 và virC đƣợc sử dụng để đánh giá hiệu quả biến nạp gen cry3 vào khoai lang thông qua vi khuẩn A. rhizogenes

cry3_F 5‘-GTTTAAGGATTATGTTTCCGCCCT-3‘ cry3_R 5‘-ATTCAAGGTTTTGGACATCCAGAG-3‘ virC_F 5'-ATCATTTGTAGCGACT-3' virC_R 5'-AGCTCAAACCTGCTTC-3' Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nƣớc deion khử trùng 12,5 2 Buffer 10x 2,5 3 dNTPs 2,0 4 DNA 5,0 5 Taq polymerase 1,0 6 Primer F 1,0 7 Primer R 1,0 Tổng 25

31

Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR

Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian (giây) Số chu kỳ

1 Biến tính 95 180 1

2 Biến tính 93 30

35

3 Gắn mồi 52 30

4 Kéo dài chuỗi 72 70

5 Hoàn tất chuỗi 72 10 phút 1 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞

2.2.5. Điện di sản phẩm PCR trên agarose, nhuộm Ethidium Bromide và đọc kết quả trên máy soi gel quả trên máy soi gel

Phƣơng pháp điện di trên gel agrose đƣợc sử dụng để kiểm tra kết quả DNA tổng số, kiểm tra các phân đoạn DNA đƣợc nhân bằng kĩ thuật PCR…

Agarose 0,8% đƣợc đun sôi, tiếp đến đƣợc hạ nhiệt độ xuống 500

– 600C, đổ dung dịch agarose vào khay gel đã cài sẵn răng lƣợc thích hợp. Sau khoảng 30 phút, khi gel đã đông cứng, tiến hành tháo lƣợc, đặt khay gel vào bể điện di. Bổ xung đệm TAE 1X vào bể sao cho gel ngập trong đệm khoảng 2mm.

Tra mẫu: Mẫu DNA đƣợc mix cùng với dye 6x, tra mẫu vào các giếng trên bản gel.

Tiến hành điện di với dòng điện một chiều với hiệu điện thế 100-130V, cƣờng độ dòng điện 60 – 80mA, đến khi vệt màu của bromophenol blue cách mép bản gel 1-2cm thì kết thúc điện di.

Nhuộm DNA bằng EtBr: Bản gel đƣợc lấy ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr (10g/ml) trong thời gian 20 phút.

Quan sát và chụp ảnh: Gel đƣợc quan sát dƣới ánh sáng tử ngoại. Quan sát thấy DNA hiện lên dƣới dạng các vạch sáng. Ảnh điện di đƣợc chụp trên máy Bio – Rad với tia UV ở bƣớc sóng 320nm.

32

2.3. Tách protein tổng số thực vật

Rễ khoai lang nuôi cấy invitro 30-45 ngày trong môi trƣờng WPM lỏng, đƣợc sử dụng để tách protein tổng số.

Rễ đƣợc rửa sạch, làm khô bằng máy hút chân không. Nghiền nhanh 0,3g mẫu trong nitơ lỏng thành bột mịn để phá vỡ cấu trúc tế bào. Chuyển toàn bộ mẫu sau nghiền vào ống eppendrof 2ml.

Bổ xung 1ml đệm chiết PBS + tween 0,05% ở nhiệt độ phòng và trộn đều. Giữ mẫu ở nhiệt độ -200

C/45 phút, sau đó làm tan mẫu ở nhiệt độ phòng, mẫu sau khi tan đƣợc đảo nhẹ. Quá trình này đƣợc lặp lại 3 lần.

Kết thúc quá trình chiết, mẫu đƣợc ly tâm 12000 vòng/phút trong thời gian 10 phút, ở 40

C.

Dùng pipet hút dịch nổi sang ống eppendrof 1,5ml. Protein thu đƣợc sau khi chiết đƣợc giữ ở nhiệt độ -200C và mang đi xác định hàm lƣợng và thử hoạt tính trên sâu non bọ hà.

2.4. Xác định hàm lƣợng protein bằng phƣơng pháp Bradford

Phƣơng pháp này dựa trên sự thay đổi bƣớc sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch mang tính acid, khi chƣa kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bƣớc sóng hấp thu cực đại 465nm; khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bƣớc sóng 595nm. Độ hấp thụ ở bƣớc sóng 595nm có liên hệ trực tiếp với nồng độ của protein có trong mẫu.

Để xác định hàm lƣợng protein trong mẫu, trƣớc tiên tiến hành xây dựng đƣờng chuẩn với dung dịch protein chuẩn bovine serum albumin (BSA) đã biết nồng độ. Sau khi cho dung dịch protein vào dung dịch thuốc nhuộm, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ. Tiến hành đo mật độ quang hỗn hợp dung dịch bằng máy quang phổ kế.

33

* Hóa chất

Dung dịch protein chuẩn BSA 20mg/ml

Dung dịch thuốc thử Bradford; đệm PBS + 0,05% tween

* Tiến hành

- Dựng đƣờng chuẩn.

Từ dung dịch protein chuẩn BSA có hàm lƣợng 20mg/ml pha loãng thành các dung dịch protein có nồng độ 0; 0,25; 0,5; 1; 2,5mg/ml bằng dung dịch đệm PBS + 0,05% tween. Bổ xung 30µl dung dịch protein đã pha loãng theo nồng độ trên vào 97µl dung dịch thuốc thử Bradford, đảo dều, để yên trong 2 phút. Sau đó tiến hành đo OD ở bƣớc song 595nm.

Từ các giá trị OD đo đƣợc và nồng độ protein dung dịch chuẩn đã biết, xây dựng phƣơng trình tuyến tính và vẽ đƣờng chuẩn giữa nồng độ protein(mg/ml) với mật độ quang OD595

- Xác định nồng độ protein trong mẫu.

Bổ xung 30µl dung dịch mẫu vào 97µl dung dịch thuốc thử Bradford, đảo dều, để yên trong 2 phút. Sau đó tiến hành đo OD ở bƣớc song 595nm.

Từ các giá trị OD595 thu đƣợc và dựa vào phƣơng trình đƣờng tuyến tính giữa nồng độ protein với mật độ quang OD595 ở trên ta tính đƣợc hàm lƣợng protein trong các mẫu phân tích.

2.5. Xác định hoạt lực diệt côn trùng của protein lên sâu non bọ hà

2.5.1. Nuôi sâu non bọ hà

Tiến hành nuôi khoảng 200 bọ hà trƣởng thành trong hộp nhựa có 3-4 củ khoai lang (150-200g mỗi củ). Giữ các hộp này trong tối ở 300C. Vòng đời của bọ hà trung bình 46 ngày, tuổi thọ 120 ngày (ở 250C) và phát triển qua các pha trứng, sâu non (tuổi 1,2,3), nhộng, trƣởng thành. Để thu đƣợc sâu non đồng đều cho thí nghiệm, cứ sau 3 ngày lại chuyển bọ trƣởng thành sang một hộp khoai mới. Sau 2

34

tuần, mỗi hộp sẽ có khoảng 500 sâu non cho thí nghiệm. Sâu non tuổi 2 là thích hợp nhất cho thí nghiệm [11].

2.5.2. Thức ăn nhân tạo cho sâu non bọ hà

Thức ăn nhân tạo cho sâu non bọ hà bao gồm 15 thành phần (phụ lục 2). Trong đó có những chất cần cho việc phát triển của sâu nhƣ cellulose, cholesterol, myo-inositol, casein, đƣờng, bột khoai lang, các vitamin và muối khoáng .... Các thành phần này đƣợc trộn lẫn với nhau, thêm agar (40g/l) và khử trùng [11].

2.5.3. Đánh giá hoạt lực của protein lên sâu non bọ hà

Thức ăn nhân tạo cho sâu non bị hà sau khi đƣợc khử trùng, làm nguội, đƣợc đổ vào các giếng của đĩa có 96 giếng với 200l thức ăn/giếng. Để khô ở nhiệt độ phòng. Sau đó, bổ xung thêm 20g; 40g/ml prtein độc tố đƣợc tách chiết ở trên lên bề mặt thức ăn, để bay hơi tự nhiên. Sử dụng đệm pha loãng protein làm đối chứng. Mỗi giếng thả một sâu non tuổi 2. Đặt đĩa sâu trong điều kiện tối ở 280C. Quan sát đĩa sâu hàng ngày để đếm số sâu chết. Lặp lại thí nghiệm 3 lần với mỗi mẫu protein tách chiết.

2.6. Phƣơng pháp sử lý số liệu

35

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân tích biểu hiện tạm thời của gen gus

Gen -glucuronidase (gus, uidA) đƣợc phân lập từ chủng E. coli RAJ201 trong plasmit pRAJ220. Gen gus mã hoá enzym -glucuronidase có khả năng thuỷ phân cơ chất -glucuronide thành sản phẩm có khả năng tạo màu xanh chàm dễ quan sát. Dựa vào ứng dụng này của gen gus, các nhà khoa học đã thiết kế gen gus

vào các vectơ chuyển gen để làm gen chỉ thị dễ thấy ở mô và tế bào thực vật mang gen chuyển [43]. Hiện nay có rất nhiều vector chuyển gen vào thực vật thông dụng đƣợc thiết kế có mang gen gus nhƣ pBI121, pCAM1301, PTN289... Các hệ vector này thƣờng đƣợc thiết kế có đoạn intron ở đầu 5‘ trƣớc gen gus và cho phép gen này chỉ biểu hiện trong tế bào thực vật.

Nhằm mục đích hoàn thiện phƣơng pháp chuyển gen và kiểm tra trƣớc khả năng biến nạp thành công gen cry3 vào rễ tơ khoai lang thông qua vi khuẩn A. rhizogens, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu biểu hiện tạm thời của gen gus ở các mảnh lá cuống lá sau thời gian đồng nuôi cấy với A. rhizogens có vector pPTN289 mang gen gus (pPTN289/Gus), là gen chỉ thị mã hóa enzyme glucuronidase, enzyme này sẽ phân giải cơ chất X-Gluc (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D- glucuronide cyclohexylamine) và chuyển thành màu xanh các mô mang gen chuyển. Sau hai ngày đồng nuôi cấy, chúng tôi tiến hành cấy chuyển các mảnh mô sang môi trƣờng WPM có bổ sung Cefotaxime 500 mg/L.

Để phân tích sự có mặt của gen gus, các mảnh mô đƣợc ngâm trong cơ chất X-Gluc (5-bromo-chloro-3-indolyl--D-glucuronide) ở 370C trong 8-12 giờ. Kết quả để xác định các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng chuyển gen vào khoai lang và đánh giá hiệu quả chuyển gen thông qua A. Rhizogens

3.1.1. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen vào khoai lang

Để tối ƣu hóa thời gian lây nhiễm chúng tôi tiến hành bố trí thí nghiệm nhƣ