3. Nội dung của đề tài
3.2.Kết quả chuyển gen cry3 vào khoai lang thông qua vi khuẩn A rhizogens
Cry3 là gen mã hóa cho mã hóa protein hình thoi có trọng lƣợng 66-73 kDa, có tác dụng gây độc với ấu trùng thuộc bộ hai cánh. Sau khi thử nghiệm các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng biến nạp của A. rhizogens với khoai lang thông qua biểu hiện tạm thời của gen gus. Chúng tôi tiến hành biến nạp gen cry3 vào khoai lang với các điều kiện tối ƣu đã đƣợc xác định ở trên.
Giống khoai lang KB1 nuôi cấy invitro có tuổi từ 7 đến 13 ngày. Các mô lá đƣợc cắt thành các mảnh có kích thƣớc 1x1cm, cuống lá, chồi ngọn đƣợc cắt thành các đoạn có chiều dài 1cm. Các mô trên đƣợc ngâm với dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes mang vector pIBT/cry3 có OD600=0,8 bổ xung thêm 100µM AS, trong thời gian 20 phút ở nhiệt độ phòng. Kết thúc thời gian lây
42
nhiễm mẫu đƣợc thấm khô bằng giấy thấm vô trùng và chuyển lên môi trƣờng đồng nuôi cấy, đƣợc giữ trong tối ở nhiệt độ 26+20
C. Sau 2 ngày đồng nuôi cấy mẫu đƣợc chuyển sang môi trƣờng chọn lọc WPM có bổ sung kháng sinh cefotaxime 500 mg/L và kanamycine 50mg/L để loại bỏ vi khuẩn còn sót trên mẫu. Mẫu đƣợc nuôi dƣới ánh sáng trắng có cƣờng độ 2000lux với thời gian chiếu sáng 12giờ/ ngày
Sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trƣờng chọn lọc, lựa chọn các dòng rễ trắng, phân nhánh nhiều, đầu rễ không bị đen, sinh trƣởng tốt đƣợc cắt và chuyển sang nuôi lắc với tốc độ 80 vòng/phút trên môi trƣờng chọn lọc WPM lỏng có bổ sung cefotaxime 500mg/L và kanamycine 50mg/L. Sau 30-45 ngày nuôi cấy lỏng trong môi trƣờng chọn lọc, chọn lựa các dòng sinh khối rễ sinh trƣởng tốt mang đi tách, tinh sạch DNA tổng số và kiểm tra kết quả biến nạp bằng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu.