Gen có hoạt tính gây độc ở Bacillus thuringiensis (Bt)

3. Nội dung của đề tài

1.4. Gen có hoạt tính gây độc ở Bacillus thuringiensis (Bt)

1.4.1. Sơ lược về Bt

Bt là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử, kỵ khí hoặc hiếu khí tùy tiện, là chủng vi khuẩn đất điển hình. Sinh trƣởng ở nhiệt độ 15-450C nhƣng thích hợp nhất ở nhiệt độ 29-320

C. Tế bào có kích thƣớc dài 3-6m có phủ tiêm mao không dày, có khả năng di động, tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi. Bào tử có dạng hình oval, trứng dài 1,6- 2m, có thể nảy mầm thành tế bào sinh dƣỡng khi gặp điều kiện thuận lợi. Tinh thể protein còn đƣợc gọi là ―thể kèm bào tử‖, có nhiều hình dạng khác nhau nhƣ: hình vuông, chữ nhật, quả trám, ô van, lập phƣơng kích thƣớc 0,6x2m hình quả trám 6 mặt. Ngay cả trong cùng một chủng đôi khi cũng xuất hiện tinh thể dƣới nhiều dạng khác nhau [6], [86]. Genome của Bt có kích thƣớc 2,4 - 5,7Mb, phần lớn có chứa một hay nhiều plasmid khác loại. Các plasmid có thể tồn tại ở dạng vòng hoặc dạng thẳng.

Bt có khả năng sản sinh protein tinh thể độc ở dạng ngoại bào (, ,  - exotoxin) và nội bào (- endotoxin). Trong các protein tinh thể độc, - endotoxin là một họ protein tinh thể độc chính gây độc hệ tiêu hoá của côn trùng. Trong các loại độc tố, thì -endotoxin (Cry toxins), -exotoxin là các độc tố đƣợc nghiên cứu

19

nhiều nhất về mặt phân tử và phổ tác dụng với côn trùng, hiện nay ngƣời ta tìm thấy và phân loại trên 300 Cry protein khác nhau, chúng tác dụng hầu hết lên các loại côn trùng thuộc Bộ Cánh vảy (Lepidoptera), Hai cánh (Diptera), Cánh cứng (Coleoptera) và Tuyến trùng (Nematoda) [33]. Các protein có hoạt tính diệt côn trùng đƣợc tổng hợp trong suốt pha sinh trƣởng muộn của vi khuẩn và đƣợc tích lũy dƣới dạng tinh thể, dạng thể vùi trong tế bào chất, hoặc đƣợc tiết vào trong môi trƣờng nuôi cấy [5], [24], [26].

Hình 1.6. Bào tử và tinh thể độc ở Bacillus thuringiensis

A-Tế bào Bt dƣới kính hiển vi điện tử; B - Tinh thể độc; C- Tinh thể độc phóng to; sp- bào tử; c-tinh thể độc

20

1.4.2. Phân loại gen mã hoá độc tố của Bt

1.4.2.1 Các gen nội độc tố cry

Có nhiều gen mã hóa cho các protein có hoạt tính diệt côn trùng của Bt (gọi tắt là gen độc) nhƣng chủ yếu là các gen cry. Mỗi một chủng Bt có thể mang một hoặc nhiều gen mã hóa cho các tinh thể độc, do đó có khả năng tổng hợp đƣợc một hay nhiều loại protein độc [75]. Các nhà khoa học đã phân tích trình tự của 50 gen mã hóa cho protein tinh thể độc. Một số gen giống nhau hoàn toàn về trình tự, một số khác gần giống nhau đại diện cho cùng một gen hoặc nhiều gen hoặc là biến dạng từ 1 gen [33].

Năm 1989, Whiteley đã xây dựng một hệ thống phân loại các gen cry. Dựa trên sự khác nhau về trọng lƣợng protein, phổ tác dụng với côn trùng đƣợc chia thành năm nhóm chính:

Gen thuộc lớp cry I (A, B, C) mã hóa protein hình thoi có trọng lƣợng 130 - 160 kDa các protein này có tác dụng gây độc với các côn trùng thuộc Bộ Cánh vảy.

Các gen thuộc lớp Cry II mã hóa protein hình tháp có trọng lƣợng 68-71 kDa. Có 3 protein Cry II (A, B, C) không giống các gen cryI các protein cryII tác động lên các côn trùng thuộc cả hai Bộ Cánh vảy và Hai cánh trong đó đặc biệt nhóm gen cryIIB chỉ có tác dụng độc với các côn trùng thuộc Bộ Cánh vảy.

Các gen cry III mã hóa protein hình thoi có trọng lƣợng 66-73 kDa, các protein của gen cry III (A, B, C, D, E) có tác dụng gây độc với ấu trùng thuộc Bộ Hai cánh.

Các gen thuộc lớp cry IV tổng hợp protein hình thoi và hình tháp, gây độc với côn trùng thuộc Bộ hai cánh, gen cry IV (A, B, C, D) mã hóa cho các protein có khối lƣợng lần lƣợt là 135, 128, 78, 72 kDa)

Nhóm gen cry V đang đƣợc nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc và chức năng. Các nhà khoa học đã xác định đƣợc trọng lƣợng phân tử protein mà chúng mã hóa khoảng 81,2 kDa, có độc tính với côn trùng thuộc Bộ Cánh cứng và Cánh vảy [86].

21

Bảng 1.2. Phân loại độc tố cry (Nguồn: Tổ chức y tế thế giới, 1999)

Gene Hình dạng tinh thể độc Trọng lƣợng protein (kDa) Tác động lên côn trùng

Cry I [phân nhóm: A(a), A(b),

B, C, D, E, F, G] Thoi 130-160 Bộ cánh vảy Cry II [phân nhóm A, B, C] Tháp 68-71 Bộ cánh vảy, hai cánh Cry III [phân nhóm A, B, C] Thoi 66-73 Bộ hai cánh Cry IV [phân nhóm A, B, C, D] Thoi/tháp 72-135 Bộ hai cánh Cry V-IX Nhiều loại 35-129 Nhiều loại

1.4.2.2. Các gen ngoại độc tố khác

Gen cytA: Là gen tổng hợp nên protein độc với tế bào động vật có xƣơng sống và không xƣơng sống, hồng cầu động vật có vú. Gen này mã hoá protein có trọng lƣợng khoảng 27kDa (trình tự không đồng nhất với bất kì gen cry nào) và hoạt tính chống côn trùng của protein này vẫn chƣa đƣợc xác định rõ. Theo một số nghiên cứu cho thấy protein này kết hợp vói một số protein do gen cryI mã hoá tạo ra phức hợp tinh thể hình trứng có tác dụng độc với côn trùng [74].

Nhóm gen vip (Vegetative Insecticidal Protein): Ngoài các gen cry tạo độc tố trong pha sinh bào tử của vi khuẩn Bacillus thuringiensis, còn có nhiều hƣớng nghiên cứu mới về gen vip. Gen vip mã hoá các protein trong pha sinh dƣỡng trong chu trình phát triển của vi khuẩn Bt và Bc có hoạt lực diệt côn trùng có phổ tác dụng mạnh hơn các protein độc do gen cry mã hóa [46]. Theo Nguyễn Trung Nam & CS sau khi sàng lọc 290 chủng Bt để tìm ra các chủng có hoạt tính diệt côn trùng nhận thấy: Hoạt lực diệt côn trùng của dịch nuôi cấy Bt ở pha log của sự phát triển tế bào vi khuẩn (trƣớc 30h) cao hơn dịch nuôi cấy ở pha tạo bào tử (72h); Số chủng Bt có hoạt tính diệt sâu ở pha log nhiều hơn so với số chủng có hoạt tính diệt sâu ở pha tạo bào tử và thời gian diệt sâu của các chủng này cũng ngắn hơn [11], [25].

22

Một số gen vip nhƣ vip1, vip2 và vip3 đã đƣợc nghiên cứu sâu về mặt phân tử và khả năng biểu hiện protein độc tố ở nhiều chủng khác nhau và các gen này đã đƣợc nhân dòng bằng kỹ thuật PCR [50]. Theo nghiên cứu của Victor & CS (2002), protein Vip3 có kích thƣớc khoảng 88,6 kDa và có hoạt tính kháng sâu xám (Agrotis ypsilon) cao gấp 260 lần so với protein CryIA và có phổ hoạt động rộng kháng một số loài côn trùng Bộ Cánh vảy nhƣ sâu xám, sâu cắn chồi thuốc lá (Heliothis virescens) và sâu xanh hại ngô (Helicoverpa zea). Trong khi đó, Selvapandiyan & CS (2001) đã xử lý dột biến mất đoạn đầu C và N của protein Vip nhằm mở rộng phổ hoạt động diệt côn trùng kháng lại nhiều loài sâu khác nhƣ sâu đục củ khoai tây (Phthrimea opercullelar), sâu đục thân ngô (Chilo partellus), sâu khoang (Spodoptera litura), sâu tơ hại cải bắp (Plutella xylostella). [67], [78].

Về cơ chế tác dụng độc của các loại protein Vip cũng đƣợc nghiên cứu và bƣớc đầu cho thấy giống nhƣ phƣơng thức tác dụng của tinh thể độc - endotoxins. Tuy nhiên protein Vip có hoạt lực sau 48-72 giờ sau khi ăn protein độc, trong khi với protein Cry là 16-24 giờ [84].

Một số nghiên cứu về mặt phân tử cho thấy có sự liên quan giữa gen vip và gen cry. Theo nghiên cứu của Sylvain & CS (2002), sự tiết một lƣợng lớn của ngoại độc tố  liên quan đến sự có mặt của cry1B và vip2. Tác giả đã phân lập và nghiên cứu 640 chủng Bt tự nhiên và nhận thấy các chủng mang gen cry1B và vip2 nằm trên cùng một plasmid là yếu tố di truyền cần thiết làm tăng lƣợng -exotoxin I ngoại bào [74].

Gần đây, đã có các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động, hoạt lực diệt côn trùng, phổ tác dụng về gen vip để tiến tới phân lập và thiếp kế tạo vector chuyển gen vào thực vật. Theo các nhà khoa học việc tìm ra các gen vip có hoạt tính diệt côn trùng mạnh và ứng dụng để tạo ra cây chuyển gen có tính kháng sâu và phổ tác động rộng hơn là vấn đề đang đƣợc quan tâm của nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới [6], [67], [74], [78], [84].

23

1.4.3. Cấu trúc và cơ chế tác động của protein cry gây độc cho côn trùng

Tinh thể độc có thể chiếm đến trên 25% trọng lƣợng khô của tế bào có bản chất là protein, đƣợc tổng hợp trong pha cân bằng của Bt. Khi nhuộm xanh metylen hoặc fusin đỏ thì độc tố bắt màu dƣới kính hiển vi đối pha tinh thể độc, chúng bền với nhiệt nhƣng lại bị mất hoạt tính khi bảo quản lâu, tiếp xúc với focmandehit 20% hay tia tử ngoại do tinh thể độc bị biến dạng hoặc bị phân hủy.

Hình 1.7. Cấu trúc của độc tố Cry 3A

(nguồn: http:// www.bioc.cam.ac.uk/UTOs/Ellar.html)

Cấu trúc không gian 3 chiều của 4 loại - endotoxin (Cry 1, Cry 2, Cry 3 và Cyt 2A) đƣợc ngiên cứu bằng kỹ thuật chiếu xạ tia X [36], [47], [48]. Protein Cry 1, Cry 2, và Cry 3 có cấu trúc tƣơng tự nhau, mỗi loại đều bao gồm 3 vùng chính.

24

Vùng I là đầu N, gồm 7 chuỗi xoắn α. Trong đó 6 chuỗi xắn ngoài bao gồm vùng ƣa nƣớc và kỵ nƣớc quấn quanh một chuỗi xoắn trung tâm. Vùng II bao gồm 3 phiến gấp  đƣợc lặp lại 3 lần, có tính đối xứng, cấu trúc nhƣ vậy của vùng II đƣợc gọi là cấu trúc ―Greek Key‖. Vùng III là đầu C của chuỗi polipeptid gồm 2 phiến gấp 

song song nối với nhau bởi đoạn peptid vòng ngắn. Mỗi vùng có có vai trò quan trọng trong hoạt tính độc tố. Vùng I có vai trò chèn vào màng tế bào và hình thành lỗ hổng. Hai vùng II và III nhận biết các thụ thể đặc hiệu. Ngoài ra vùng III cũng tham gia vào tạo ra các lỗ hổng trên màng tế bào [37], [28].

Các protein độc của Bt hoạt động có chung một cơ chế tác động gây độc chung với côn trùng gồm 3 bƣớc chính [6], [24], [ 33], [35], [41].

Sau khi côn trùng ăn phải các tinh thể độc (tiền độc tố), các tinh thể độc đƣợc hòa tan ở ruột giữa côn trùng do ở đây có pH kiềm (pH 10-12), tạo thành các chuỗi protein tiền độc tố có trọng lƣợng 130-135kDa, dƣới tác động của môi trƣờng có pH>10 và sự hoạt động của enzym protease ở ruột giữa của ấu trùng phân giải tiền độc tố tạo ra protein dạng hoạt hoá có kích thƣớc khoảng 55-75 kDa.

Độc tố sau khi đƣợc hoạt hoá gắn với các phân tử thụ thể đặc hiệu trên màng các tế bào biểu bì ruột giữa côn trùng.

Sau khi gắn kết, độc tố chèn vào màng tế bào và làm thay đổi gradient điện hoá do tạo ra các lỗ và các kênh chọn lọc và không chọn lọc. Điều này dẫn đến sự phá huỷ cân bằng áp suất thẩm thấu trong và ngoài màng tế bào, là nguyên nhân làm tế bào trƣơng và bị vỡ, làm cho côn trùng không tiêu hoá đƣợc thức ăn dẫn đến chết. Sự chết của côn trùng diễn ra nhanh chóng, xác chết đã cung cấp dinh dƣỡng cho sự sinh trƣởng của Bacillus thuringiensis từ những bào tử.

25

Hình 1.8. Mô hình hoạt động của protein Cry gây độc đối với côn trùng [56]

1.4.4. Một số thành tựu tạo cây khoai lang chuyển gen

Cũng nhƣ các cây lƣơng thực khác, các phƣơng pháp tạo cây khoai lang chuyển gen đã đƣợc tiến hành nghiên cứu từ những năm 1987. Đã có rất nhiều các nghiên cứu nhằm tăng cƣờng khả năng tái sinh cây khoai lang in vitro [51], [49], và các nghiên cứu hệ thống chuyển gen sử dụng vector chỉ thị bằng phƣơng pháp bắn gen [65]. Hay thông qua Agrobacterium để chuyển gen [83]. Song song với các nghiên cứu hệ thống tái sinh cây và chuyển gen là nghiên cứu phân lập các gen kháng côn trùng cry, vip, gen mã hoá lectin, gen dự trữ protein ở củ, các gen tăng cƣờng hàm lƣợng axit amin cần thiết asp1, gen kháng virus SPMFV... và các promoter liên quan [82]. Gần đây, một số công trình nghiên cứu đã công bố về tạo cây khoai lang chuyển gen có ích nhƣ gen

26

cry kháng côn trùng; gen mã hoá chất ức chế proteinase, kháng virus thông qua hệ thống chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium [58].

Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về hệ thống tái sinh và hệ thống chuyển gen vào cây khoai lang sử dụng vector mang gen chỉ thị để nhằm mục đích hoàn thiện qui trình chuyển gen làm cơ sở cho bƣớc chuyển gen có giá trị sau này [6], [7], [13].

27

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị

2.1.1. Vật liệu a. Thực vật: a. Thực vật:

Thực vật đƣợc sử dụng trong nghiên cứu là các mảnh lá, đoạn thân và chồi giống khoai lang KB1 thu thập từ Viện khoa học nông nghiệp Việt Nam, nuôi cấy trong điều kiện in vitro. Giống khoai lang này đang đƣợc giữ tại phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

b. Chủng vi khuẩn:

- Chủng Agrobacterium rhizogenes ATCC15834/PTN289 (Viện Sinh học phân tử và Dƣợc học, Trƣờng Đại học Heidelberg, CHLB Đức)

- Chủng Agrobacterium rhizogenes pIBT/cry3

2.1.2. Hóa chất

Các môi trường nuôi cấy:

- Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn: YMP - Môi trƣờng nuôi cấy thực vật MS

- Môi trƣờng đồng nuôi cấy và cảm ứng tạo rễ tơ: WPM

Các loại kháng sinh: Kanamycine, Cefotaxime, Spectinomycine.

Các hóa chất thông dụng trong sinh học phân tử (thang marker chuẩn, agarose, phenol, chloroform, isoamylalcholhol... ) thuộc phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học mua từ các hãng nổi tiếng nhƣ Invitrogen, Merk, Amersham Parmacia Biotech, Fermentas, New England Biolabs...

2.1.3. Thiết bị

Các thiết bị dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật: box cấy vô trùng, bình nuôi cây, nồi khử trùng, bể ổn nhiệt, máy nuôi lắc, máy đo pH. Kính hiển vi điện tử soi nổi (Olympus SZX ILLK 100, Japan)…

28

Một số thiết bị dùng trong sinh học phân tử: máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di PowerPac 300 (Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh, máy soi gel, máy ly tâm, máy hút chân không, máy đo OD, máy vortex .., cùng với các trang thiết bị khác của phòng Công nghệ tế bào thực vật và Phòng thí nghiệm trọng điểm gen, Viện Công nghệ sinh học.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Chuyển gen thông qua Agrobacterium

2.2.1.1. Tạo dịch huyền phù Agrobacterium

Cấy trải Agrobacterium cất giữ trong glyxerol lên đĩa môi trƣờng YEP thạch có bổ sung spectinomycine 50 mg/L, nuôi ở 280

C trong 36-48 giờ. Sau đó lấy một khuẩn lạc vi khuẩn nuôi trong 5ml môi trƣờng YEP lỏng có bổ sung 50mg/L spectinomycine nuôi ở nhiệt độ 280C, sau 8 giờ, chuyển toàn bộ 5ml dịch nuôi cấy trên sang 45ml môi trƣờng YMP lỏng có bổ sung 50mg/L spectinomycine nuôi lắc 220 vòng/phút ở nhiệt độ 280C, sau 16-18 giờ lấy dịch huyền phù vi khuẩn nuôi cấy trên ly tâm với tốc độ 6000-6500 vòng/ phút, ở 40

C trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi và hoà tan cặn với môi trƣờng 1/2 MS (pH=5,8) và pha loãng cho tới OD600  0.5- 0.9. Dịch huyền phù vi khuẩn này có thể đƣợc sử dụng để biến nạp ngay hay có thể giữ ở 40

C trong 1-2 giờ.

2.2.1.2. Nhiễm vi khuẩn với mảnh lá

Lá bánh tẻ và đoạn thân của các cây khoai lang nuôi cấy in vitro đƣợc cắt thành những mảnh nhỏ có kích thƣớc 1cm2. Những mảnh lá, cuống lá và các chồi này sau đó đƣợc ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn khoảng 10-30 phút ở nhiệt độ phòng sau đó đƣợc đặt lên môi trƣờng WPM nuôi trong tối 48 giờ, ở nhiệt độ 260

C

 20C.

Sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trƣờng cảm ứng các mảnh lá đƣợc chuyển sang môi trƣờng chọn lọc.

29

2.2.2. Đánh giá cây trồng chuyển gen qua biểu hiện tạm thời của gen gus.

Thƣờng sử dụng dung dịch muối 5-Br-4-Cl-3-indolyl β-D-glucuronide cyclohexylamine (X-Gluc) để nhuộm mô tế bào [11], [20]. Sản phẩm sơ cấp 5-Br-4- Cl-3indolyl vẫn còn là một chất dễ tan, không màu. Nhƣng ngay sau đó sản phẩm này bị ôxy hóa và dimmer hóa thành một phức hệ không tan có màu xanh. Sự có mặt của ferri và ferrocyanide trong dung dịch nhuộm làm tăng quá trình hình thành sản phẩm cuối cùng, đồng thời cũng góp phần hạn chế việc khuếch tán sản phẩm sơ cấp đến vùng không có gus [3].

Các bộ phận khác nhau của cây chuyển gen đƣợc ngâm trong dung dịch đệm