3. Nội dung của đề tài
2.4. Xác định hàm lƣợng protein bằng phƣơng pháp Bradford
Phƣơng pháp này dựa trên sự thay đổi bƣớc sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch mang tính acid, khi chƣa kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bƣớc sóng hấp thu cực đại 465nm; khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bƣớc sóng 595nm. Độ hấp thụ ở bƣớc sóng 595nm có liên hệ trực tiếp với nồng độ của protein có trong mẫu.
Để xác định hàm lƣợng protein trong mẫu, trƣớc tiên tiến hành xây dựng đƣờng chuẩn với dung dịch protein chuẩn bovine serum albumin (BSA) đã biết nồng độ. Sau khi cho dung dịch protein vào dung dịch thuốc nhuộm, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ. Tiến hành đo mật độ quang hỗn hợp dung dịch bằng máy quang phổ kế.
33
* Hóa chất
Dung dịch protein chuẩn BSA 20mg/ml
Dung dịch thuốc thử Bradford; đệm PBS + 0,05% tween
* Tiến hành
- Dựng đƣờng chuẩn.
Từ dung dịch protein chuẩn BSA có hàm lƣợng 20mg/ml pha loãng thành các dung dịch protein có nồng độ 0; 0,25; 0,5; 1; 2,5mg/ml bằng dung dịch đệm PBS + 0,05% tween. Bổ xung 30µl dung dịch protein đã pha loãng theo nồng độ trên vào 97µl dung dịch thuốc thử Bradford, đảo dều, để yên trong 2 phút. Sau đó tiến hành đo OD ở bƣớc song 595nm.
Từ các giá trị OD đo đƣợc và nồng độ protein dung dịch chuẩn đã biết, xây dựng phƣơng trình tuyến tính và vẽ đƣờng chuẩn giữa nồng độ protein(mg/ml) với mật độ quang OD595
- Xác định nồng độ protein trong mẫu.
Bổ xung 30µl dung dịch mẫu vào 97µl dung dịch thuốc thử Bradford, đảo dều, để yên trong 2 phút. Sau đó tiến hành đo OD ở bƣớc song 595nm.
Từ các giá trị OD595 thu đƣợc và dựa vào phƣơng trình đƣờng tuyến tính giữa nồng độ protein với mật độ quang OD595 ở trên ta tính đƣợc hàm lƣợng protein trong các mẫu phân tích.