2.4.4.1. Kỹ thuật xét nghiệm nước tìm đơn bào, trứng và ấu trùng giun, sán
- Lấy mẫu xét nghiệm [62] + Dụng cụ:
Phiếu lấy mẫu nước.
Chai lấy mẫu nước: chai có dung tích 1,5 lít, được rửa sạch bằng cát, xà phòng, dung dịch Na2CO3 1%, rửa lại bằng HCl 1% và tráng với nước cất. Quang chai để lấy mẫu, bút viết nhãn.
+ Cách lấy mẫu: chúng tôi sử dụng kỹ thuật lấy mẫu đơn (lấy một mẫu) cho mỗi nguồn nước được sử dụng tại mỗi hộ gia đình.
+ Kỹ thuật lấy mẫu:
Lượng nước cần lấy cho một mẫu: 1 lít. Kỹ thuật lấy:
. Lấy nước tại vòi: mở vòi cho nước chảy vài phút rồi mới lấy nước vào chai. Trước khi lấy nước xét nghiệm phải tráng chai bằng chính nước của nguồn nước được lấy mẫu xét nghiệm. Nếu không có vòi để lấy nước thì mẫu nước sẽđược lấy bằng chính dụng cụ mà hộ gia đình đó sử dụng.
. Lấy nước giếng khơi, ao hồ và sông ngòi: chúng tôi sử dụng quang chai để lấy mẫu. Khi miệng chai chìm xuống dưới mặt nước 30- 50cm, rút dây mở nắp chai.
Trong quá trình lấy, tránh va chạm vào các vị trí khác như thành giếng, bờ ao hồ hoặc sông ngòi.
Bảo quản: mẫu nước lấy xong được dán nhãn, ghi rõ nguồn nước và mã số. Mẫu nước được xét nghiệm tìm ký sinh trùng trong vòng 4 tiếng.
- Kỹ thuật xét nghiệm mẫu nước tìm mầm bệnh [61], [59], [5] + Chuẩn bị
. Phiếu ghi kết quả xét nghiệm (Phụ lục 2) . Dụng cụ xét nghiệm:
Kính hiển vi Axiostar vật kính 10 và 40, máy ly tâm, ống nghiệm, cốc thủy tinh, vòng kim loại, ống hút, lam kính, lá kính.
. Hóa chất:
Nacl 40%.
Sulfat kẽm tỷ trọng 1,180. Dung dịch Lugol kép.
+ Tiến hành:mẫu nước được để lắng cặn trong vòng 4 tiếng. Sau đó, gạn phần nước trong ở trên, thu hồi cặn.
Cặn ít:
Cho cặn vào ống nghiệm, ly tâm với tốc độ 1500- 2000 vòng/phút trong 3 phút. Đổ phần nước ở trên, dùng pipet hút cặn nhỏ lên lam kính, đặt lamen lên và đem soi tìm mầm bệnh dưới vật kính 10 và 40 [59].
Cặn nhiều:
. Làm nổi trứng giun theo phương pháp Fulleborn [59], [5].
Cho nước muối bão hòa vào trong ống nghiệm, dùng que xét nghiệm đánh tan cặn. Để thời gian 15- 20 phút cho trứng giun nổi lên. Dùng vòng kim loại đường kính 1cm thu hồi váng nổi trên bề mặt ống nghiệm, đặt lá kính lên và đem soi dưới kính hiển vi vật kính 10 tìm trứng giun, sán.
. Làm nổi kén đơn bào theo phương pháp Faust [5]
Cho dung dịch Sulfat Kẽm có tỷ trọng 1,180 vào trong ống nghiệm và đánh tan cặn. Để thời gian 30- 40 phút với mục đích làm nổi kén của các loại đơn bào. Sau đó, dùng vòng kim loại hoặc ống hút thu hồi phần váng nổi trên bề mặt dung dịch trong ống nghiệm đặt lên lam kính. Nhỏ lên đó 1 giọt Lugol kép, đặt lá kính lên và đem soi dưới kính hiển vi vật kính 40 tìm đơn bào.
2.4.4.2. Kỹ thuật điều tra kiến thức và thực hành của người dân
Chúng tôi sử dụng bộ phiếu với bộ câu hỏi được thiết kế sẵn để phỏng vấn trực tiếp người dân tại địa bàn nghiên cứu những kiến thức, thực hành về mầm ký sinh trùng nguồn nước, tác hại và phương thức lan truyền cũng như cách phòng bệnh ký sinh trùng lây truyền qua nước, cách bảo quản, vệ sinh và sử dụng các nguồn nước phục vụ cho sinh hoạt (phụ lục 1).
Trước khi được sử dụng chính thức, bộ phiếu đã được chuyên gia đóng góp và chỉnh sửa. Điều tra viên là cán bộ của bộ môn Ký sinh trùng và khoa Y tế công cộng Trường Đại học Y Dược Thái Bình, đều là những điều tra viên có kinh nghiệm. Trước khi tiến hành phòng vấn tại địa bàn nghiên cứu, các cán bộ điều tra đã được tập huấn và điều tra thử để thống nhất.
2.4.4.3. Kỹ thuật tiến hành nghiên cứu thực nghiệm
• Kỹ thuật thu thập, nuôi cấy mầm bệnh và gây nhiễm động vật - Chuẩn bị[59], [5]:
+ Dụng cụ: kính hiển vi Axiostar thị kính 10, vật kính 10 và vật kính 40, ống nghiệm, cốc thủy tinh, vòng kim loại, ống hút, lam kính, lá kính, bút dạ, bô can, giá để tiêu bản, que tre, giấy thấm có kích thước 1cm × 12,5cm, giấy Cellophan, miếng cao su xốp để dàn phân, mặt kính lõm.
+ Hóa chất:
Nước muối sinh lý
Dung dịch Kato (xanh Malachit 3% 1 phần+ Glycerin 100 phần + Nước cất 100 phần)
Nước muối bão hòa Axit Chlohydric 1% Dung dịch Barbagallo
+ Phiếu ghi kết quả thực nghiệm (Phụ lục 3)
- Kỹ thuật thu thập trứng giun đũa, trứng giun móc/mỏ [59], [5]
+ Kỹ thuật xét nghiệm phân bằng phương pháp Kato tìm mầm bệnh. Lấy khoảng 40- 60 mg phân đặt lên trên mặt lam kính. Đặt giấy celophane đã thấm dung dịch Kato lên trên và dùng nút cao su dàn đều phân dưới giấy celophane. Sau khi dàn phân, để tiêu bản 30 phút ở nhiệt độ phòng rồi đem soi dưới kính hiển vi vật kính 10 xác định mầm bệnh.
+ Kỹ thuật tách trứng giun từ phân bằng phương pháp Fulleborn.
Lấy khoảng 5 - 10 gam phân cho vào cốc thủy tinh. Đổ vào cốc một ít nước muối bão hòa, dùng que tre đánh tan phân. Tiếp tục cho nước muối bão hòa vào gần đầy cốc, ngoáy đều. Dùng que vớt hết các chất cặn bã nổi trên bề mặt cốc rồi để khoảng 1 tiếng với mục đích làm nổi hết trứng giun có trong bệnh phẩm. Dùng vòng kim loại có đường kính 1 cm vớt hết váng nổi trên bề mặt. Cho váng vào ống nghiệm, đổ nước cất vào rửa 2- 3 lần cho sạch nước muối bão hòa rồi thu hồi trứng giun.
- Kỹ thuật thu thập mầm bệnh đơn bào Cryptosporidium spp [59], [5]
Nước được để lắng 6 tiếng, thu hồi cặn. Sau khi làm nổi đơn bào bằng phương pháp Faust, mầm bệnh được rửa với nước cất 2- 3 lần.
- Kỹ thuật nuôi cấy trứng giun [59], [5]
Trứng giun lấy từ phương pháp Fulleborn sau khi chịu tác động với các biện pháp thực nghiệm được đặt lên mặt lõm của kính để trong nhiệt độ thích hợp cho trứng phát triển: trứng giun đũa là 260C và trứng giun tóc, trứng giun móc là 300C.
Để ngăn các loại nấm mốc không ảnh hưởng đến sự phát triển, cho trứng giun đũa và trứng giun móc vào dung dịch Barbagallo. Để môi trường luôn ẩm ướt, thỉnh thoảng cho thêm nước. Hằng ngày, theo dõi dưới kính hiển vi sự phát triển của trứng giun tóc, trứng giun đũa. Riêng với trứng giun móc, phải theo dõi hàng giờ.
+ Xác định trứng chết: chất bên trong trứng và vỏ trứng có thay đổi, thoái hoá. Đôi khi, vỏ ngoài nguyên vẹn nhưng bên trong có không bào mỡ.
+ Xác định trứng có ấu trùng sống hay chết: ép trứng cho vỏ vỡ, ấu trùng thoát ra ngoài. Nhuộm ấu trùng, nếu ấu trùng sống sẽ không bắt màu.
- Kỹ thuật gây nhiễm cho mèo [45], [59]
Mèo nhịn ăn một ngày trước khi gây nhiễm. Sau khi gây mê cho mèo bằng ether, người phụ nâng cao 2 chân sau của mèo. Người gây nhiễm banh hậu môn mèo bằng tay trái, tay phải cầm ống thông có bôi glyxerin luồn sâu vào đại tràng khoảng 15 cm qua hậu môn. Dùng bơm tiêm loại 5 ml bơm bào nang Cryptosporidium spp. vào đại tràng rồi nút hậu môn mèo bằng bông. Sau 24 giờ bỏ bông và cho mèo ăn bình thường. Theo dõi tình trạng của mèo. Thường sau 10 ngày, mèo đato thải bào nang. Xét nghiệm phân mèo tìm đơn bào 3 lần trong khoảng thời gian theo dõi.
+ Nếu 3 lần đều tìm thấy bào nang hoặc thể hoạt động của trùng roi trong phân mèo, liều thực nghiệm này không có khả năng tiêu diệt bào nang.
+ Nếu 3 lần xét nghiệm có 01 hoặc 02 lần không tìm thấy bào nang hoặc thể hoạt động của trùng roi, liều thực nghiệm có khả năng ức chế sự phát triển của bào nang nhưng vẫn không có khả năng tiêu diệt.
+ Nếu 3 lần xét nghiệm không tìm thấy bào nang hoặc thể hoạt động của trùng roi, liều thực nghiệm có khả năng tiêu diệt bào nang.
• Phương pháp thử nghiệm
- Lô chứng
+ Trứng giun: trứng giun sau khi được thu hồi từ bệnh phẩm, mầm bệnh không qua xử lý được nuôi cấy. Thời gian nuôi trứng giun móc/mỏ là 24 giờ và trứng giun đũa là 28 ngày. Theo dõi trong suốt quá trình nuôi cấy để đánh giá sự phát triển.
+ Cryptosporidium spp.: bào nang Cryptosporidium spp. không qua xử lý được gây nhiễm cho mèo. Theo dõi mèo 14 ngày sau gây nhiễm.
- Lô thực nghiệm
+ Khử khuẩn nước với ozone: Thực nghiệm với trứng giun
Trứng giun thực nghiệm với ozone ở các nồng độ 0,01ppm; 0,05ppm; 0,1ppm; 0,5ppm và các mốc thời gian 10, 15, 30, 60 và 180 phút.
Trứng sau khi thực nghiệm được thu hồi và nuôi cấy đánh giá tỷ lệ phát triển thành ấu trùng.
Thử nghiệm với bào nang Cryptosporidium spp.
Đưa bào nang vào bình chứa 500 ml nước cho một lần thực nghiệm. Bào nang được tiếp xúc với ozone nồng độ 0,01ppm; 0,05ppm; 0,1ppm; 0,5ppm. Mỗi nồng độđể ở mốc thời gian 10, 15, 30, 60 và 180 phút. Lắng cặn sau 6 giờ, gạn lấy phần dưới đem ly tâm thời gian 2 phút với tốc độ 1.500 vòng/phút để thu hồi bào nang. Gây nhiễm bào nang cho mèo và theo dõi hàng ngày, sau 14 ngày xét nghiệm phân mèo tìm bào nang.
+ Khử khuẩn nước với viên khử khuẩn Aquatabs: Thực nghiệm với trứng giun
Nước được pha với viên Aquatabs với tỷ lệ theo hướng dẫn sử dụng. Trứng giun đưa vào nước đã được khử khuẩn bằng Aquatabs với mốc thời gian 10, 15, 30, 60 và 180 phút. Trứng sau khi thực nghiệm được thu hồi và nuôi cấy đánh giá tỷ lệ phát triển thành ấu trùng.
Thực nghiệm với bào nang Cryptosporidium spp.
Đưa bào nang vào ống nghiệm với nước đã được khử khuẩn bằng viên khử khuẩn Aquatabs và đểở các mốc thời gian tương tự như với trứng giun.
Ly tâm thời gian 2 phút với tốc độ 1.500 vòng/phút thu hồi bào nang. Gây nhiễm cho mèo và theo dõi hàng ngày liên tục trong 14 ngày.
+ Phương pháp xử lý bằng nhiệt độ Thực nghiệm với trứng giun
Trứng giun đũa và trứng giun móc được đưa vào nước và thực nghiệm ở các mức nhiệt độ: 500C, 550C, 600C, 700C, 800C và 900C. Mỗi mức nhiệt độ được để ở các mốc thời gian 5 phút, 10 phút, 15 phút. Trứng sau khi thực nghiệm được thu hồi và nuôi cấy đánh giá tỷ lệ phát triển thành ấu trùng.
Thực nghiệm với bào nang Cryptosporidium spp.
Đưa bào nang vào ống nghiệm với nước và thực nghiệm ở các mức nhiệt độ: 500C, 550C, 600C, 700C, 800C và 900C. Mỗi mức nhiệt độđược để ở các mốc thời gian 1 phút, 5 phút và 10 phút. Ly tâm 2 phút với tốc độ 1.500 vòng/phút thu hồi bào nang. Gây nhiễm cho mèo, theo dõi hàng ngày. Sau 14 ngày xét nghiệm phân tìm bào nang.