4.1.1 Đặc điểm chung của mẫu nghiên cứu
Trong tổng số 246 bệnh nhân đƣợc chẩn đoán xác định hiện đang mắc bệnh lao phổi tái trị, có chỉ định thực hiện xét nghiệm kháng sinh đồ, chúng tôi ghi nhận các đặc điểm chung của bệnh nhân nhƣ sau:
Bảng 4.1 Đặc điểm giới tính, nhóm tuổi của bệnh nhân nghiên cứu
Đặc điểm Số lƣợng (n=246) Tỷ lệ (100%) Giới Nam 195 79,3 Nữ 51 20,7 Nhóm tuổi <30 tuổi 25 10,2 30 – 60 tuổi 170 69,1 >60 tuổi 51 20,7
Tại Bảng 4.1 kết quả nghiên cứu đã chỉ ra:
- Có đến 195/246 bệnh nhân là nam giới chiếm tỷ lệ là 79,3 %, trong khi đó nữ giới chỉ có 51/246 bệnh nhân, chiếm tỷ lệ 20,7 %.
- Nhóm tuổi đƣợc ghi nhận nhiều nhất ở bệnh nhân nghiên cứu là nhóm từ 30-60 tuổi, với 170/246 bệnh nhân, chiếm tỷ lệ 69,1%; kế đến là nhóm >60 tuổi với 51/246 bệnh nhân, chiếm tỷ lệ 20,7%; Nhóm tuổi <30 chỉ có 25/246 bệnh nhân, chiếm tỷ lệ 10,2%. Bệnh nhân nhỏ tuổi nhất là 16 tuổi và lớn nhất là 92 tuổi.
4.1.2 Tỷ lệ kháng thuốc ở bệnh nhân lao phổi tái trị tại thành phố Cần Thơ
Tất cả các mẫu đàm của 246 bệnh nhân đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng đặc biệt Lowenstein-Jensen dành cho vi khuẩn lao, sau từ 4 đến 6 tuần, các vi khuẩn mọc thành những khuẩn lạc, thực hiện các phản ứng sinh hóa để định danh vi
khuẩn, các chủng trực khuẩn Mycobacterium tuberculosis sau khi định danh sẽ
đƣợc cấy vào môi trƣờng đặc Lowenstein-Jensen có chứa các loại thuốc kháng sinh chống lao (còn gọi là thuốc chống lao hàng 1). Kết quả nghiên cứu thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
61
4.1.2.1 Tỷ lệ kháng thuốc chung của vi khuẩn lao
Hình 4.1 Tỷ lệ kháng thuốc chung của vi khuẩn lao
Từ Hình 4.1 cho thấy, tỷ lệ kháng thuốc chung của các chủng vi khuẩn lao trên các bệnh nhân lao phổi tái trị tại thành phố Cần Thơ là 157/246 bệnh nhân chiếm tỷ lệ là 63,8%; KTC: 95% (57,3-69,9) .
So sánh với một số nghiên cứu khác (Bảng 4.2), chúng tôi thấy rằng có sự khác biệt về tỷ lệ kháng thuốc chung của bệnh nhân mắc lao phổi tái trị giữa các Quốc gia trên thế giới cũng nhƣ tại các tỉnh thành trong nƣớc
Bảng 4.2 So sánh tỷ lệ mắc lao phổi kháng thuốc chung ở các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
Thành phố/Quốc gia Tỷ lệ kháng chung (%)
Baku thuộc Azerbaijan (WHO-2009) Tashkent, Uzbekistan (WHO-2009) Iran (2011)
Thƣợng Hải Trung quốc (2009) Tiền Giang (2008)
Hải Phòng (2011)
Phía nam Việt Nam (2006) Cần Thơ 84,4 85,9 69,0 27,9 60,0 53,9 62,9 63,82
Hai nơi có tỷ lệ kháng thuốc chung cao nhất trên thế giới là Thủ đô Baku thuộc Azerbaijan (84,4%) và Tashkent, Uzbekistan (85,9%) (WHO, 2008) cũng nhƣ khi so với các nƣớc nhƣ Iran với tỷ lệ mắc lao phổi kháng thuốc chung là 69 % (Muayad et al, 2011); trong một nghiên cứu tại Thƣợng Hải Trung quốc cho
62
kết quả tỷ lệ kháng chung là 27,9 % (Shen et al, 2009); thấp hơn tỷ lệ kháng thuốc chung trong nghiên cứu này của chúng tôi tại Cần Thơ. Nếu so với các kết quả nghiên cứu trong nƣớc, nhƣ ở Tiền Giang có tỷ lệ kháng chung là 60% (Trần
Ngọc Bửu và ctv, 2008), Hải Phòng có tỷ lệ kháng chung là 53,9% (Phan Xuân
Trƣờng và ctv, 2011) thì kết quả nghiên cứu của chúng tôi tƣơng đối phù hợp và
kết quả này cũng cho thấy rằng, tỷ lệ kháng thuốc chung tại thành phố Cần Thơ (trong nghiên cứu này của chúng tôi) nói riêng và của các tỉnh khác trong toàn quốc thì Việt Nam thuộc vào nhóm có tỷ lệ kháng thuốc chung cao trung bình.
4.1.2.2 Tỷ lệ các loại kháng thuốc của vi khuẩn lao
Tỷ lệ lao phổi đa kháng thuốc ở bệnh nhân nghiên cứu
Hình 4.2 Tỷ lệ mắc lao phổi đa kháng thuốc ở bệnh nhân nghiên cứu
Tại Hình 4.2 kết quả nghiên cứu cho thấy có 57/246 bệnh nhân mắc lao phổi đa kháng thuốc (MDR-TB), chiếm tỷ lệ là 23,2%; KTC: 95% (18,3 – 28,9).
So sánh với tỷ lệ lao phổi đa kháng thuốc ở một số nơi khác (Bảng 4.3), cũng cho thấy có sự khác biệt về tỷ lệ lao phổi đa kháng giữa các vùng khác nhau.
63
Bảng 4.3 So sánh kết quả tỷ lệ lao phổi đa kháng thuốc với các nghiên cứu khác Thành phố/Quốc gia Tỷ lệ lao phổi đa kháng (%) Việt Nam ( 2004-2005)
Tiền Giang (2008) Hải Phòng (2011) Thƣợng Hải (2009) Thái Lan (2009)
Baku thuộcAzerbaijan (WHO-2008) Tashkent, Uzbekistan (WHO-2008) Gujarat, Ấn Độ (WHO-2008) Iran (2011) Cần Thơ (chúng tôi, 2014) 19 14,0 33,6 9,7 34,5 55,8 60,0 17,2 31,7 23,2
Từ Bảng 4.3 cho thấy, khi so với số liệu của chƣơng trình chống lao quốc gia đã công bố qua 3 lần điều tra bắt đầu từ năm 1996 (lần thứ 1 từ 1996-1997, lần thứ 2 từ 2001-2002, lần thứ 3 từ 2004 – 2005) với kết quả lao đa kháng ở Việt Nam lần lƣợt là 32,5%; 23,5% và 19% (Đinh Ngọc Sỹ, 2011) cho thấy tỷ lệ lao đa kháng thuốc ở Việt Nam ngày càng giảm dần. Kết quả điều tra lần 4 năm 2011, tỷ lệ lao đa kháng thuốc trên toàn quốc ở nhóm lao phổi tái trị là 17,1%, cho thấy tỷ lệ lao đa kháng thuốc ở Việt Nam lại tiếp tục giảm (CTCLQG, 2014); trong khi đó, kết quả nghiên cứu của chúng tôi thì tỷ lệ lao phổi đa kháng thuốc là
23,2%. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Phan Xuân Trƣờng và ctv,
(2011) tại Hải Phòng với tỷ lệ lao đa kháng thuốc là 33,6%%; khi nghiên cứu cùng trên nhóm đối tƣợng này Thái Lan có tỷ lệ lao phổi đa kháng thuốc là 34,5
% (Suksont et al, 2009), Tại Iran, tỷ lệ lao đa kháng thuốc cũng khá cao (31,7%)
(Muayad et al, 2011), các kết quả này đều cao hơn kết quả của chúng tôi. Điều này gợi ý rằng, phải chăng tình hình lao đa kháng thuốc đang có chiều hƣớng tăng trở lại?
Theo WHO (2008), hai quốc gia có tỷ lệ lao phổi đa kháng thuốc cao nhất thế giới là Thủ đô Baku thuộc Azerbaijan (55,8%) và Tashkent, Uzbekistan (60%), Trong khi đó, một số nghiên cứu ngoài nƣớc khác nhƣ nghiên cứu của
Shen et al, (2009) tại Thƣợng Hải với tỷ lệ lao đa kháng thuốc là 9,7% ở nhóm
lao phổi tái điều trị và ở bang Gujarat - Ấn Độ, tỷ lệ lao phổi đa kháng thuốc là 17,2% ở nhóm bệnh nhân có tiền căn lao phổi đã đƣợc điều trị trƣớc đây.
64
Nguyên nhân của hiện tƣợng lao kháng thuốc cao ở các khu vực, cũng nhƣ tại các Quốc gia có thể do hoạt động của các chƣơng trình chống lao trong quá
khứ không đạt hiệu quả. Theo báo cáo của Lê Văn Nhi và ctv, (2011) tại hội nghị
khoa học về bệnh phổi toàn quốc lần thứ IV, đã đƣa ra nhận định rằng sự lƣu hành bệnh lao đa kháng thuốc có liên quan đến một số yếu tố sau: 1) Tình hình quản lý bệnh lao trong quá khứ; 2) Tình hình quản lý bệnh lao hiện tại; 3) Sự lan truyền của vi khuẩn lao đa kháng thuốc. Ngoài 3 yếu tố trên, tỷ lệ lao đa kháng thuốc còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nữa, nhƣ độc lực của vi khuẩn và sự cảm thụ của ngƣời bệnh đối với bệnh lao (yếu tố HLA).
Tỷ lệ mắc lao phổi đơn kháng thuốc ở bệnh nhân nghiên cứu
65
Từ Hình 4.3 cho kết quả về các loại kháng đơn thuốc của vi khuẩn lao, lần lƣợt nhƣ sau: kháng với thuốc streptomycin chiếm tỷ lệ 52,4% (129/246 bệnh nhân), (KTC 95%: 41,9-55,4) là thuốc có tỷ lệ kháng cao nhất trong 5 loại thuốc chống lao hàng1; Kế đến là isoniazid chiếm 47,2% (116/246 bệnh nhân) (KTC 95%: 39,6-52,3); Kháng rifampicin chiếm 25,2% (62/246 bệnh nhân) (KTC 95%: 17,6-28,4); Kháng ethambutol chiếm 11,8% (29/246 bệnh nhân) (KTC 95%: 4,1- 11,3); Kháng pyrazinamid là 9,8% (24/246 bệnh nhân) (KTC 95%: 4,5-11,3).
Kết quả này cho thấy tỷ lệ đơn kháng với các thuốc chống lao hàng 1 của chúng tôi cao hơn nhiều so với báo cáo điều tra lao kháng thuốc lần thứ 4 của Việt Nam đƣợc tiến hành vào năm 2011 với tỷ lệ kháng với thuốc streptomycin là 32,9%, với thuốc isoniazid là 34,8%, kháng với rifampicin là 18%, kháng ethambutol 9,3% (CTCLQG, 2014).
Kết quả của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của Trần Ngọc Bửu và ctv,
(2008) tại Tiền Giang với tỷ lệ kháng streptomycin khá cao (54%), kế đó là isoniazid (44%), rifampicin (15%) và ethambutol (3%). Nhƣng lại khác với
nghiên cứu của Phan Xuân Trƣờng và ctv, (2011) tại Hải Phòng, kết quả kháng
cao nhất là với isoniazid (76,8%); kế đó là với rifampicin (75,4%), kháng với streptomycin là 11,6% và với ethambutol là 5,8%.
Số liệu báo cáo từ WHO (2008) thì tỷ lệ kháng với ít nhất một loại thuốc chống lao hàng 1 dao động từ 0 % (ở các nƣớc Châu Âu) đến 85,9 % (ở Taskent,
Uzbekistan). Theo Muayad et al, (2011) nghiên cứu hồi cứu tại Iran cho thấy tỷ lệ
kháng đơn thuốc ở những bệnh nhân có tiền sử đã đƣợc điều trị thuốc chống lao nhƣ sau: kháng cao nhất với isoniazid (45,3%), kế đó là kháng với streptomycin là 40,6%, kháng với rifampicin (36,2%), kháng với pyrazinamid là 24,4% và kháng với ethambutol là 30,3%.
Theo nghiên cứu của Shen et al, (2009), tại Thƣợng Hải, Trung Quốc thì tỷ
lệ kháng với isoniazid là 19,6%, kháng với rifampicin là 13,4%, với streptomycin là 17,9% và kháng với ethambutol là 3,1% trên những bệnh nhân có tiền sử đã đƣợc điều trị lao trƣớc đây.
66
Tỷ lệ kháng thuốc chống lao kết hợp
Hình 4.4 Tỷ lệ các loại lao phổi kháng thuốc kết hợp
Từ Hình 4.4 kết quả nghiên cứu cho thấy chiếm cao nhất là tỷ lệ bệnh nhân kháng chỉ 1 loại thuốc 21,5% (53/246 bệnh nhân, KTC 95%: 16,7-26,8); kế đó lần lƣợt là kháng kết hợp 2 loại thuốc 17,1% (42/246 bệnh nhân, KTC 95%: 12,6- 21,5); kháng kết hợp 3 loại thuốc là 13,4% (33/246 bệnh nhân, KTC 95%: 9,3- 17,9); kháng kết hợp 4 loại thuốc là 8,5% (21/246 bệnh nhân, KTC 95%: 5,3- 12,6) và kháng cả 5 loại thuốc chống lao là 3,3% (8/246 bệnh nhân, KTC 95%: 1,2-5,7).
Nghiên cứu tại Iran cho kết quả thấp hơn của chúng tôi với tỷ lệ kháng với 2 loại thuốc là 8,1%, kháng với hơn 2 loại thuốc là 3,2% (Muayad et al, 2011). Theo báo cáo tổng hợp của Caminero (2010) đã chứng minh có mối liên quan nhân quả giữa một chƣơng trình chống lao tốt ở những thập kỷ trƣớc với một tỷ lệ kháng thuốc thấp ở hiện tại và ngƣợc lại.
4.2 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến tính kháng thuốc của vi khuẩn lao nghiên cứu 4.2.1 Các kiểu đột biến gen gây kháng thuốc rifampicin của vi khuẩn lao tại 4.2.1 Các kiểu đột biến gen gây kháng thuốc rifampicin của vi khuẩn lao tại thành phố Cần Thơ
Trong số 42 chủng vi khuẩn lao (lấy từ các mẫu đàm đã đƣợc nuôi cấy và định danh) có kết quả kháng sinh đồ kháng thuốc chống lao hạng 1, trong đó có 40 chủng vi khuẩn lao đa kháng (kháng với rifampicin và isoniazid) và 2 chủng còn nhạy với thuốc rifampicin, ADN của 42 chủng vi khuẩn trên đƣợc thu nhận sau quá trình ly trích, sử dụng các mẫu DNA làm khuôn cho việc khuếch đại đoạn gen rpoB với cặp mồi đặc hiệu, sản phẩm PCR thu đƣợc có chiều dài 411bp là
67
vùng gen có chứa 81bp (hay còn gọi là RRDR: rifampicin resistance determining region) của gen rpoB (Yuen et al. 1999).
Vị trí của sản phẩm PCR với chiều dài 411bp khi so với thang chuẩn sau khi chạy điện di trên bảng gel nhƣ minh họa tại Hình 4.5
Hình 4.5 Sản phẩm PCR có chiều dài 411bp trên bảng gel
(chụp tại phòng sinh học phân tử-Viện NC&PT CNSH-Đại học Cần Thơ)
Sau khi đƣợc tinh sạch sản phẩm PCR đƣợc gửi giải trình tự đoạn gen rpoB để xác định tần suất và các kiểu đột biến gen của vi khuẩn lao đa kháng thuốc.
Hình 4.6 Các đỉnh của các nucleotid trên biểu đồ giải trình tự
Kết quả giải trình tự gen rpoB minh họa tại Hình 4.6 cho thấy các đỉnh (peak) có 4 màu thể hiện 4 loại nucleotid, sử dụng 2 phần mềm Mega 5.0 và BioEdit 7.0.5.3 để phân tích và so sánh kết quả giải trình tự đoạn RRDR của gen rpoB từ các chủng vi khuẩn lao kháng rifampicin trong nghiên cứu của chúng tôi với chủng vi khuẩn lao nguyên thủy trên ngân hàng gen NCBI: Hình ảnh đột biến
68
ở Hình 4.6 cho thấy tại vị trí có base Adenine (A) hiện diện trên chủng vi khuẩn lao nguyên thủy bị thay thế thành base Thymine (T) trên chủng vi khuẩn lao kháng thuốc nghiên cứu (thể hiện trong khung màu đỏ). Đây chính là kiểu đột biến thay thế một base của bộ ba codon, chính sự thay thế này sẽ gây ảnh hƣởng làm thay đổi trình tự của chuỗi acid amin sau quá trình dịch mã để tạo thành phân tử RNA polymerase của vi khuẩn lao. Nhƣ vậy, cấu trúc phân tử RNA polymerase của chủng vi khuẩn lao kháng thuốc đã bị thay đổi. Do đó làm thay đổi vị trí đích tác động của thuốc rifampicin.
Trong 40 chủng vi khuẩn lao ở những bệnh nhân lao phổi tái trị đã có kết quả kháng sinh đồ đƣợc xác định đang mắc lao phổi đa kháng thuốc, kết quả nghiên cứu này của chúng tôi đã chỉ ra có 30/40 chủng vi khuẩn xảy ra đột biến trên vùng xác định kháng với thuốc rifampicin chiếm tỷ lệ 75%, có 10/40 chủng vi khuẩn lao trong nghiên cứu mặc dù có kết quả kháng sinh đồ đƣợc xác định đang mắc lao phổi đa kháng thuốc nhƣng kết quả giải trình tự vùng 81bp của gen rpoB đã không phát hiện đột biến
Hình 4.7 Tỷ lệ đột biến kháng RMP của các chủng vi khuẩn lao đa kháng Kết quả đột biến của 30/40 chủng vi khuẩn lao trong nghiên cứu này của chúng tôi với các kiểu đột biến sau:
75% 25%
Đột biến
69
4.2.1.1 Các kiểu đột biến thay thế nucleotid gây thay đổi acid amin
Khi sử dụng 2 phần mềm Mega 5.0 và BioEdit 7.0.5.3 để so sánh trình tự của các nucleotid nằm trên vùng xác định kháng RMP (còn gọi là vùng RRDR - Rifampicin Resistance Determining Region) của gen rpoB có chiều dài 81bp từ các chủng vi khuẩn lao đa kháng thuốc tại thành phố Cần Thơ, chúng tôi ghi nhận đƣợc có 13 codon mang kiểu đột biến bị thay thế các base
Bảng 4.4 Các kiểu đột biến thay thế base có thay đổi acid amin Codon Thay đổi
nucleotide
Thay đổi acid amin Số lƣợng (n=40)
Tỷ lệ (100%) 507 GGC GAC Glycine Aspartic acid 1 2,5 510 CAG GAG Glutamine Glutamic acid 3 7,5
511 CTG GTG Leucine Valine 2 5 513 CAA CTG TTG Glutamine Leucine Glutamine Leucine 2 5 516 GAC GTC GCC
Aspartic acid Valine Aspartic acid Alanine
2 2
5 5
517 CAG AAG Glutamine Glycine 1 2,5
518 AAC ACC Asparagine Threonine 1 2,5
519 AAC AGC Asparagine Serine 1 2,5
522 TCG GCC Serine Alanine 1 2,5 523 GGG GTG Glycine Valine 7 17,5 531 TCG TTG TGT AAC Serine Leucine Serine Cysteine Serine Asparagine 8 2 1 20,0 5 2,5 532 GCG CCG Alanine Proline 1 2,5 533 CTG CGG CCG ACG Leucine Arginine Leucine Proline Leucine Threonine 2 3 1 5 7,5 2,5
Khi thực hiện giải trình tự tìm đột biến gen kháng thuốc rifampicin của 42 chủng vi khuẩn lao (thu thập từ mẫu đàm của bệnh nhân mắc lao phổi đa kháng thuốc tại thành phố Cần Thơ), chúng tôi ghi nhận:
- Cùng với 40 chủng vi khuẩn lao đã đƣợc xác định có kháng với thuốc rifampicin qua kết quả kháng sinh đồ, chúng tôi còn thực hiện giải trình tự thêm 2 chủng vi khuẩn lao còn nhạy với thuốc rifampicin tại TP Cần Thơ, 2 chủng vi khuẩn này đƣợc dùng để kiểm chứng, kết quả đã chỉ ra rằng trình tự vùng chứa 81bp (RRDR) của đoạn gen rpoB ở 2 chủng vi khuẩn lao còn nhạy với thuốc rifampicin hoàn toàn giống với chủng nguyên gốc từ ngân hàng gen NCBI
70
(GeneBank database (accession no. L27989) (Yuen et al. 1999). Có nghĩa là,
không có sự đột biến gen ở 2 chủng vi khuẩn lao còn nhạy với thuốc rifampicin - Ngƣợc lại, phân tích 40 chủng vi khuẩn lao đƣợc xác định có kháng thuốc rifampicin, kết quả cho thấy, những chủng vi khuẩn lao này mang kiểu đột biến thay thế các nucleotid gây thay đổi các acid amin trên 13 codon của đoạn gen rpoB vùng có trình tự xác định kháng thuốc RMP chứa 81bp (RRDR) từ bộ ba 507 đến 534 (Bảng 4.4) với các tần suất đột biến nhƣ sau:
1) Tại codon 507 có 1/40 (2,5%) vi khuẩn mang đột biến kiểu base GGC
Lysine GAC Aspartic acid.
2) Tại codon 510 có 3/40 (7,5%) vi khuẩn mang đột biến base CAG
Glutamine GAG Glutamic acid.
3) Tại codon 511 có 2/40 (5%) vi khuẩn mang đột biến base CTG Leucine
GTG Valine.
4) Tại codon 513 có 2/40 (5%) vi khuẩn mang kiểu đột biến base CAA