c. Sự phân bố kích thước mao quản
2.3. Nghiên cứu phản ứng oxi hoá glucozơ
60
Phản ứng được thực hiện ở pha lỏng trong bình cầu 3 cổ dung tích 50ml. Dung dịch glucozơ ban đầu có nồng độ 1,6 M. Sử dụng oxi không khí là tác nhân oxi hoá. Tốc độ dòng khí được điều chỉnh bằng thiết bị đo tốc độ dòng Flow Meter 110 AC. Dung dịch kiềm được dùng để điều chỉnh pH (Hình 2.10). Tỉ lệ xúc tác : glucozơ là 1: 1000 (mol). Theo thời gian phản ứng, từng phần nhỏ hỗn hợp (0,5 ml) được lấy ra và đem phân tích bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Hình 2.10: Mô hình thiết bị phản ứng oxi hoá glucozơ
Độ chuyển hóa được tính theo công thức :
Độ chọn lọc S của cấu tử i xác định theo công thức: NaOH Flow Meter 110 H2O Glucozơ Không khí/( 2) N2 % Sản phẩm % Nguyên liệu C,% = = x 100
61
2.3.2.Chế tạo các muối natri gluconat và kali gluconat
Chế tạo muối natri gluconat
Hoà tan , gam glucozơ monohidrat vào trong 100ml nước rồi chuyển vào bình phản ứng có chứa 0,01gam xúc tác Au/MCM-41. Không khí được cung cấp với tốc độ 20 ml/phút, điều chỉnh bằng Flo-Meter 110, đồng thời ổn định nhiệt độ ở 500C. Điều chỉnh pH đến bằng dung dịch Na H 0,5M và thực hiện phản ứng oxi hoá glucozơ. Theo thời gian, axit sinh ra làm pH của dung dịch phản ứng giảm dần, vì vậy trong thời gian phản ứng, liên tục thêm kiềm để ổn định pH ở . Lượng kiềm tiêu tốn trong khi phản ứng tương ứng với lượng axit sinh ra. Tiếp tục thực hiện phản ứng đến khi pH không giảm. Lọc lấy dung dịch phản ứng.
Chuyển dung dịch này vào cốc, thêm vào 150ml cồn tuyệt đối, đưa vào thiết bị làm lạnh, nhiệt độ ~ 40C trong 24 giờ, tinh thể muối natri gluconat tạo thành lắng ở đáy cốc. Lọc gạn lấy tinh thể và rửa sạch bằng cồn tuyệt đối. Làm khô ở nhiệt độ thường trong 1 ngày.
Muối thu được hoà tan lại trong nước, sau đó kết tinh lại trong cồn lạnh. Lọc rửa và sấy khô sản phẩm ở 800C, được tinh thể muối natri gluconat màu trắng. Lượng muối thu được là 8,65 gam.
Chế tạo muối kaligluconat
Kali gluconat được tổng hợp với quy trình tương tự như natri gluconat. Dung dịch điều chỉnh pH và tạo muối là K H 0,5M. Muối kali gluconat thu được ở dạng tinh thể màu trắng, có khối lượng là ,21gam
2.3.3.Phân tích sản phẩm phản ứng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
% Sản phẩm i
% Tổng sản phẩm
62
Sản phẩm của quá trình oxi hóa D-glucozơ là các chất có chứa nhiều nhóm H trong phân tử nên có khả năng tạo các liên kết cầu hiđro, độ nhớt các chất này thường lớn nên khó bay hơi được. Vì vậy, để xác định được thành phần sản phẩm cũng như độ chọn lọc và độ chuyển hóa của phản ứng thường phải sử dụng phương pháp phân tích sắc kí lỏng.
Hình 2.11: Sơ đồ khối của một thiết bị sắc ký lỏng (HPLC)
Nguyên tắc của quá trình sắc ký lỏng:
Quá trình tách trong H LC là những quá trình tổ hợp của nhiều quá trình vừa có tính chất hóa học vừa có tính chất lý học. Quá trình này là những cân bằng động xảy ra ở trong cột sắc kí giữa pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng. Nó là sự vận chuyển và phân bố của chất tan (hỗn hợp m u) theo từng lớp qua pha tĩnh. Trong quá trình đó chất tan luôn luôn được phân bố lại giữa hai pha, khi pha động luôn luôn chảy qua cột với một tốc độ nhất định. Do tính chất cân bằng động nên luôn luôn có sự vận chuyển của chất tan từ pha này sang pha kia và ngược lại. Nghĩa là đối với một phân tử chất tan, thì trong quá trình sắc kí nó luôn
Pha động
Bơm chân không Nạp mẫu tự động
Cột tách
Oven
Detectơ
Xử lý dự liệu
Mẫu thải sau khi phân tích
63
luôn chuyển từ pha này sang pha kia nhiều lần từ đầu cột đến cuối cột sắc kí. Mặc khác, cũng vì cấu trúc và tính phân cực của mỗi phân tử của chất là khác nhau nên tốc độ dịch chuyển trung bình của mỗi chất tan là khác nhau. Như vậy là có một thời gian nhất định, chất tan bị giữ lại trong cột sắc kí. Thời gian chất tan bị pha tĩnh lưu giữ gọi là thời gian lưu, được quyết định bởi bản chất, cấu tạo của pha tĩnh, cũng như cấu trúc và tính chất của mỗi chất cần phân tích là khác nhau. Đồng thời cũng phụ thuộc vào bản chất và thành phần của pha động dùng để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột. Vì thế trong quá trình sắc kí có chất tan bị lưu giữ lâu trong cột, có chất tan kém bị lưu giữ. Điều đó d n đến kết quả là quá trình tách của các chất xảy ra trong cột sắc kí. Nếu ghi lại quá trình tách sắc kí đó của hỗn hợp m u phân tích chúng ta có một sắc đồ gồm nhiều pic. Các pic có thể tách nhau hoàn toàn hoặc cũng còn có nhiều phần chập nhau. Sắc ký đồ đó phản ánh quá trình tách sắc kí ở trong cột có tốt hay không. Trong quá trình sắc kí, chất nào bị lưu giữ mạnh nhất sẽ được rửa giải ra khỏi cột sau cùng, chất nào bị lưu giữ kém nhất sẽ được rửa giải ra trước tiên. Các đetectơ sẽ dò nhận sự biến đổi tín hiệu điện khi có mặt chất phân tích và cho tín hiệu là pic chất trên sắc đồ. Thông thường, dựa vào thời gian lưu, có thể định tính được chất phân tích bằng cách so sánh với thời gian lưu của chất chuẩn trong cùng điều kiện phân tích.
Trong quá trình sắc ký, hai yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng để kết quả phân tích là sự tách chất và xác định các chất. Sự tách chất được quyết định bởi pha tĩnh trong cột tách. Tương ứng với mỗi loại pha tĩnh có một loại sắc ký riêng trong kỹ thuật tách H LC. Các loại cơ bản là: Sắc ký hấp phụ pha thường và pha đảo; Sắc ký trao đổi ion; Sắc ký chiết và Sắc ký rây phân tử. Yếu tố quan trong thứ hai ảnh hưởng để kết quả phân tích là sự xác định các tín hiệu chất, quyết định bởi đêtectơ. Trong kỹ thuật H LC, việc tách của các chất xảy ra liên tục, do đó, đêtectơ là bộ phận theo dõi phát hiện các chất tan trong pha động chảy ra từ cột sắc ký một cách cũng liện tục. Nó thu nhận và phát hiện chất theo một tính chất
64
vật lý hay tính chất hoá lý nào đó của chất phân tích trong một vùng nồng độ nhất định với mối quan hệ sau:
A = k.C
Trong đó: A là tín hiệu đo của chất phân tích theo tính chất đó. C là nồng độ của chất phân tích trong m u và k là hằng số của điều kiện thực nghiệm của đêtectơ đã chọn. Tín hiệu đo A có thể là: Độ hấp thụ quang phân tử của chất, Cường độ phát xạ của vạch phổ, Cường độ dòng điện, điện thế, Độ d n điện, d n nhiệt, Chiết suất, chỉ số khúc xạ của chất phân tích, ….Tương ứng với những tính chất đó, là các loại đêtectơ khác đặc trưng trong H LC. Một số đêtectơ dung cho phân tích các hợp chất axit và đường đó là:
a) Đêtectơ hấp thụ quang UV-VIS
Là đetectơ được dung phổ biến nhất. Đêtectơ này phát hiện các chất phân tích dựa trên cơ sở tính chất hấp thụ quang phân tử của nó tại một độ dài sóng nào đó. Việc định lượng dựa theo định luật hấp thụ quang:
A = log
IIo Io
= E.C.l
Trong đó: A: Mật độ hấp thụ quang của chất phân tích E: Độ tắt phân tử
L: Bề dày lớp hấp phụ (chiều dài flowcell)
b)Đetectơ chỉ số khúc xạ (RID)
Nguyên tắc xác định chất là dựa trên cơ sở tính chất khúc xạ của chùm tia sáng giữa hai môi trường có chiết suất khác nhau. Do sự thay đổi nồng độ chất phân tích chảy qua flowcell của detectơ sẽ làm thay đổi chiết suất của pha động và sự thay đổi này làm biến đổi cường độ chùm sang chiếu qua flowcell. Từ đó tạo ra sự thay đổi chiết suất của pha động khi không có chất m u và khi có chất m u với các nồng độ khác nhau. Sự thay đổi này trong một phạm vi nồng độ chất phân tích nhất định phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ chất m u trong pha động:
65
n = k.C
Trong đó n là sự thay đổi chiết suất của pha động, C là nồng độ chất phân tích trong pha động và k là hệ số thực nghiệm của các điều kiện đo n và cấu tạo máy đo chiết suất.
Chiết suất của chất phân tích được tính theo công thức: Pi = k.(ni0 - n0)
n0 và ni0 là chiết suất của pha động không có và có chất phân tích, k là hệ số tỉ lệ. RID là đetectơ có độ nhạy cao và tính chọn lọc cao song thường bị ảnh hưởng bởi điều kiện môi trường thực hiện phép đo, đặc biệt là nhiệt độ. Công thức tính trên cũng cho thấy rằng chất phân tích phải có chiết suất lớn hay khi hoà tan trong pha động phải tạo sự chênh lệch rõ rệt về chiết suất so với pha động thì mới được phát hiện tốt bởi đetectơ này. Các hợp chất đường và sản phẩm chuyển hoá từ đường rất thích hợp với đetectơ này.
Thực nghiệm:
Thiết bị phân tích:
- Sắc kí ion LC20 Dionex - Đêtectơ RI-101 shodex
- Cột polypore CA, artial size 10μm. Chương trình phân tích:
- ha động: H2O
- Tốc độ dòng: 0.4 ml/phút - Áp suất 650 SI
- Nhiệt độ detector: 300C