2.2.3.1. Phương pháp định lượng LDH
Dùng phương pháp động học đo hoạt độ enzym để định lượng LDH trong huyết thanh và huyết tương trên máy phân tích OLYMPUS AU640 và được tiến hành tại khoa hóa sinh bệnh viện trung ương quân đội 108.
* Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên khuyến nghị của " Liên đoàn Hóa Học Lâm sàng và Xét nghiệm Y học Quốc tế”:
Lựa chọn đối tượng
Khai thác tuổi, giới, bệnh sử, lâm sàng
Các xét nghiệm LDH, B2M, albumin Giải phẫu bệnh Chẩn đoán hình ảnh Đặc điểm nhóm BN nghiên cứu
Khảo sát sự biến đổi các chỉ số LDH, B2M, albumin trước, trong và sau điều trị.
Đánh giá mối liên quan giữa các chỉ số LDH, B2M, albumin với kết quả điều trị
LDH
Lactate + NAD+ Pyruvate + NADH + H+
LDH xúc tác cho quá trình oxy hóa lactate thành pyruvate cùng với sự tham gia của NAD+ để tạo thành NADH. Sự gia tăng của NADH được đo tại bước sóng 340 nm, giá trị này tỉ lệ thuận với hoạt tính của enzym trong mẫu. * Hóa chất:
- Thuốc thử R1: đệm D(-)N-Methylglucamin pH 9,7 325 mmol/L Lactate 50 mmol/L - Thuốc thử R2: Cơ chất NAD+ 10 mmol/L Máy tự động hút 80µl R1 và 40 µl R2 cho phân tích.
* Bệnh phẩm:
- Huyết thanh hoặc huyết tương được chống đông bằng heparin. - Ổn định trong 4 ngày ở 2-8oC, 7 ngày ở 15-25oC
Không sử dụng bệnh phẩm bị vỡ hồng cầu do trong hồng cầu LDH cao gấp 150 lần ngoài huyết thanh.
Máy tự động hút 3µl bệnh phẩm cho phân tích. * Tiến hành:
Bệnh phẩm được phân tích tự động theo quy trình của máy phân tích OLYMPUS AU640 và máy in tự động in ra kết quả.
2.2.3.2. Phương pháp định lượng B2M
Định lượng nồng độ B2M bằng kỹ thuật ELISA tại khoa miễn dịch, bệnh viện trung ương quân đội 108.
* Nguyên tắc:
B2M ELISA dựa trên nguyên lý bánh kẹp “sandwich”, kit của hãng DRG-Đức. Giếng nhựa có gắn Streptavidin sẽ bắt các kháng thể kháng B2M thứ nhất gắn với Biotin. Nếu trong huyết thanh có B2M thì chúng sẽ gắn với kháng thể này trên giếng nhựa. Kháng thể thứ 2 (enzyme conjugate) có gắn enzym peroxydase sẽ kết hợp với phức hợp trên để tạo thành phức hợp Kháng
thể - Kháng nguyên (B2M) – Kháng thể gắn enzym peroxydase. Khi cho cơ chất, các enzym peroxydase sẽ làm chuyển màu cơ chất. Mức độ chuyển màu cơ chất tỷ lệ thuận với nồng độ B2M có trong mẫu bệnh phẩm xét nghiệm và các chuẩn.
* Hóa chất:
- 96 giếng nhựa có gắn Streptavidin
- 01 bộ chuẩn B2M ở các nồng độ 0; 0,75; 1,5; 3; 6; 12 µg/ml - 01 lọ dung dịch pha loãng mẫu: 20 ml
- 01 lọ enzym conjugate: 15 ml - 01 lọ Biotin: 11 ml
- 01 lọ TMB: 15 ml
- 01 lọ Stop Solution 1M HCl: 15 ml - 01 lọ dung dịch rửa: 20 ml
Hóa chất được bảo quản ở nhiệt độ 2-8oC, để ở nhiệt độ phòng 30 phút trước khi thực hiện xét nghiệm.
* Bệnh phẩm:
- Máu toàn phần ở tĩnh mạch ly tâm chắt lấy huyết thanh hoặc huyết tương, tránh để vỡ hồng cầu và có sợi đông dây (fibrin).
- Nếu xét nghiệm làm ngay mẫu để ở nhiệt độ 2-8oC, nếu bảo quản lâu giữ ở nhiệt độ -20oC.
* Tiến hành:
- Mẫu bệnh phẩm được chuẩn bị đánh dấu theo thứ tự và pha loãng theo tỉ lệ 1/100 (10 µl huyết thanh hoặc huyết tương + 1ml dung dịch pha loãng mẫu) - Nhỏ 100 µl các chuẩn (không cần pha loãng), chứng 1, chứng 2 vào các giếng tương ứng.
- Nhỏ 100 µl huyết thanh hoặc huyết tương bệnh phẩm đã pha loãng vào các giếng tiếp theo.
- Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa theo thể tích 300 µl / giếng và hút sạch - Nhỏ 100 µl enzym conjugate, ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút
- Rửa 5 lần bằng dung dịch rửa theo thể tích 300 µl/ giếng và hút sạch - Nhỏ 100 µl dung dịch TMB vào mỗi giếng
- Để ở nhiệt độ phòng 15 phút tránh ánh sáng
- Thêm 100 µl dung dịch dừng phản ứng và đọc mật độ quang ở bước song 450nm trên máy READER-230 trong vòng 5 phút.
- Kết quả được tính toán dựa trên đồ thị vẽ bằng giấy logarit hoặc phần mềm TCWIN2.
* Một số vấn đề cần lưu ý:
- Không sử dụng sinh phẩm quá hạn - Không để vỡ hồng cầu
- Độ nhạy của phản ứng B2M ELISA phát hiện được đến 0,1 µl/ml.
2.2.3.3. Phương pháp định lượng albumin
* Nguyên tắc:
Định lượng albumin trong máu theo phương pháp so màu (do phức hợp của albumin với Bromocresol Green (BCG)
pH4,2
Albumin + BCG Green Complex * Hóa chất:
- Hóa chất của hãng Olympus
+ Đệm succinate (pH4,2) 100 mmol/L + Bromocresol green 0,2 mmol/L
Bảo quản tránh ánh sáng, ổn định trong 30 ngày sau khi mở nắp và bảo quản trên máy.
- Huyết thanh kiểm tra chất lượng của hãng Olympus. * Bệnh phẩm:
- Ổn định trong 7 ngày ở 2-25oC.
* Tiến hành: Bệnh phẩm được phân tích trên máy phân tích AU 400 và AU 640 và máy tự động cho ra kết quả.