2.3.1 Đối tượng thí nghiệm
Chuột được sử dụng làm thí nghiệm là chuột đực, 16 ngày tuổi, khối lượng khoảng 15 ÷ 16 g/cá thể. Chuột nhắt trắng do Viện Pasteur TP. HCM cung cấp có đặc điểm phân loại như sau:
Bộ: Rodentia
Họ: Muridae
Họ phụ: Murinae
Loài: Mus musculusdo
Hình 2.2 Chuột nhắt trắng dùng trong nghiên cứu
Chuột nhắt trắng (cùng với chuột cống trắng) là loài động vật gặm nhấm được sử dụng làm động vật thí nghiệm về bệnh học và đặc biệt là thí nghiệm liên quan đến độc tính của thuốc [5]. Ngoài ra, chuột đã được chứng minh là động vật có khả năng chuyển hóa beta-carotene thành vitamin A cao nhất trong các loài thú [8]. Vì các lý do trên nên chuột nhắt trắng được chọn làm đối tượng để khảo sát về tính an toàn, các biểu hiện trên vật nuôi và khả năng chuyển hóa beta-carotene thành vitamin A.
2.3.2 Thành phần thức ăn đối chứng
Thức ăn cho chuột do Viện Pasteur TP. HCM cung cấp có thành phần dinh dưỡng như bảng 2.10.
Bảng 2.10 Thành phần dinh dưỡng của thức ăn đối chứng cho chuột Số TT Chỉ tiêu phân tích Thành phần (% Klg) 1. Độẩm (%) 13 2. Hàm lượng đạm tổng 19,85 3. Hàm lượng lipid 6,74 4. Dẫn xuất không đạm 52,74 5. Hàm lượng xơ tổng số 4,15 6. Hàm lượng tro tổng số 3,52
2.3.3 Bố trí thí nghiệm trên đàn chuột
Mỗi cá thể chuột nhắt trắng được nuôi trong một chuồng để xác định số gam thức ăn chuột ăn trong ngày. Chuồng được đặt ở cùng điều kiện như nhiệt độ, ánh sáng, độ thoáng, trấu... . Đảm bảo cung cấp đủ nước cho chuột [5].
Chuột thí nghiệm được chia thành 4 lô thí nghiệm. Mỗi lô gồm 9 cá thể chuột (chọn chuột đực, 16 ngày tuổi), khoảng 15 ÷ 16 g/cá thể. Sau 15 ngày thí nghiệm xác định tỷ lệ cá thể chết/sống, các chỉ số máu, hàm lượng vitamin A và beta-carotene trong huyết thanh, hàm lượng Ca, P trong xương và P trong phân của từng cá thể chuột thí nghiệm. Tỷ lệ thức ăn sử dụng trong thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của chế phẩm βCR lên chuột nhắt trắng như sau:
Lô 1: chuột ăn 100% thức ăn Viện Pasteur (thức ăn đối chứng - ĐC); Lô 2: chuột ăn thức ăn gồm 75% thức ăn đối chứng + 25% chế phẩm βCR; Lô 3: chuột ăn thức ăn gồm 50% thức ăn đối chứng + 50% chế phẩm βCR; Lô 4: chuột ăn thức ăn gồm 25% thức ăn đối chứng + 75% chế phẩm βCR.
2.3.4 Các chỉ tiêu và phương pháp khảo sát
2.3.4.1 Phương pháp cho chuột ăn và xác định khối lượng chuột
- Chuột được cho ăn thức ăn đã bổ sung chế phẩm βCR. Lượng thức ăn hằng ngày chỉ bằng 1/2 nhu cầu thực tế của chuột (half-feed) để đảm bảo chúng ăn hết, không bỏ thức ăn thừa [5]. Thức ăn được cung cấp cho chuột 2 lần/ngày (vào 8 giờ và 20 giờ).
- Khối lượng của chuột được xác định 3 ngày một lần.
- Sau mỗi 3 ngày, khẩu phần ăn của chuột được tăng lên một lần.
2.3.4.2 Phương pháp đếm số lượng hồng cầu
- Pha dung dịch trộn hồng cầu Marcano gồm Na2SO4: 5 g; formol: 1 ml; nước cất: 100 ml. Bảo quản trong điều kiện phòng và sử dụng trong tuần;
- Vệ sinh buồng đếm và ống trộn;
- Chích gốc đuôi chuột, dùng ống trộn hồng cầu hút máu đến vạch 0,5. Hút tiếp dung dịch trộn hồng cầu đến vạch 10 (máu được pha loãng 200 lần). Lắc đều ống trộn
hồng cầu, bỏ 3 giọt đầu, cho một giọt lên buồng đếm hồng cầu và xác định số hồng cầu trong buồng đếm;
- Đếm số hồng cầu trong 5 ô lớn (80 ô nhỏ) trên buồng đếm được giá trị A. Đếm lặp lại 3 lần [125]. Số tế bào hồng cầu trong 1 mm3 máu: N = A x 10000
2.3.4.3 Phương pháp đếm số lượng bạch cầu
- Dung dịch trộn bạch cầu gồm acid acetic 5 ml; xanh methylen 2 ÷ 5 giọt; nước cất vừa đủ 100 ml;
- Thao tác tương tựđếm hồng cầu (mục 2.3.4.2);
- Đếm số bạch cầu trong 25 ô lớn (400 ô nhỏ) trên buồng đếm được giá trị B. Đếm lặp lại 3 lần [125].
- Số lượng tế bào trong 1 mm3 máu: N = B x 200
2.3.4.4 Xác định hàm lượng hemoglobin
Dựa trên sự oxi hóa hemoglobin và sự chuyển hóa methahemoglobin thành cyanmethahemoglobin có màu đỏ bởi dung dịch Drabkin (hỗn hợp sodium bicarbonate, potassium cyanic, potassium ferricyanic) người ta có thể xác định được hàm lượng hemoglobin bằng phương pháp đo OD ở bước sóng 540 nm [13].
2.3.4.5 Phương pháp thu nhận chất thải từ lồng nuôi chuột
- Chuột được nuôi 02 ngày với thức ăn có bổ sung chế phẩm βCR, sau đó vệ sinh sạch lồng nuôi.
- Từ ngày thứ 03, thu nhận toàn bộ phân trước mỗi lần cho ăn và vệ sinh lồng nuôi chuột.
- Cân 2,5 g phân trong ngày được cho vào erlen 250 ml, lắc liên tục trên máy lắc ngang với tốc độ 200 vòng/phút trong 30 phút và xác định hàm lượng phosphor.
2.3.4.6 Phương pháp thu nhận xương chuột
Sau mỗi 15 ngày nuôi, tiến hành mổ toàn bộ cá thể chuột trong mỗi lô. Thu nhận xương 4 chi của mỗi cá thể, xương được loại bỏ hết phần thịt và gân. Ngâm rửa xương trong nước cất nóng và loại bỏ chất béo trong xương bằng dung dịch diethyl ether. Rửa
sạch và sấy khô đến khối lượng không đổi để xác định khối lượng của xương [125]. Tiến hành tro hóa (mục 2.2.7.6) để xác định hàm lượng calci (mục 2.3.4.7) và phosphor (mục 2.3.4.8).
2.3.4.7 Phương pháp xác định hàm lượng calci theo phương pháp chuẩn độ
TCVN 1526: 1986
Dùng Trilon B xác định calci trong dung dịch mẫu với chỉ thị là Murexid (C8H5O6N5)(xem phụ lục 5.3.1).
2.3.4.8 Phương pháp xác định hàm lượng phosphor theo TCVN 1525:2001
Tương tự 2.2.5.6., từ mật độ OD đo được dựa vào phương trình đường chuẩn xác định hàm lượng phosphor có trong mẫu (xem phụ lục 5.3.2).
2.3.4.9 Phương pháp thu nhận máu
Sau 15 ngày nuôi, thực hiện mổ toàn bộ các cá thể trong mỗi lô, máu được thu nhận toàn bộ để tiến hành xác định hàm lượng hemoglobin (theo mục 2.3.4.4), hàm lượng beta-carotene và vitamin A trong huyết thanh chuột.
2.3.4.10 Phương pháp xác định beta-carotene và vitamin A trong huyết thanh
Lấy lượng máu xác định cho vào ống nghiệm có chứa 1 ml lithium citrate nồng độ 20%. Lắc thật kỹ rồi cho vào máy ly tâm 30 phút với tốc độ 2800 vòng/phút. Lấy dịch huyết thanh mang xác định hàm lượng beta-carotene và vitamin A [53].
2.4 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CHẾ PHẨM TRÊN GÀ ĐẺ TRỨNG 2.4.1 Đối tượng, địa điểm thí nghiệm
2.4.1.1 Đối tượng thí nghiệm
Gà thí nghiệm là giống gà chuyên trứng IsaBrown (giống gà của Pháp) nhập từ Thái Lan. Bắt đầu thí nghiệm khi gà ở giai đoạn 26 tuần tuổi và kết thúc vào 42 tuần tuổi.
2.4.1.2 Địa điểm thí nghiệm
Các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của chế phẩm βCR lên gà đẻ trứng được tiến hành tại Doanh nghiệp Tư nhân Mai Thủy với quy mô 30.000 con, địa chỉ thôn Bầu Điển, xã Đá Bạc, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu.
Các thí nghiệm kiểm tra chất lượng trứng được thực hiện tại phòng thí nghiệm bộ môn chăn nuôi chuyên khoa, Khoa Chăn nuôi - Thú y, Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
2.4.2 Thành phần thức ăn đối chứng
Thức ăn đối chứng dùng cho gà IsaBrown là thức ăn đậm đặc GD26 Star Feed do Công ty cổ phần chăn nuôi CP VN cung cấp có thành phần gồm bắp, bột đậu nành, cám gạo, bột cá, khoai mì, vitamin, khoáng vi lượng, acid amin, không có hoormon hay kháng hoormon với các chỉ tiêu như bảng 2.11 (theo thông tin in trên bao bì).
Bảng 2.11 Thành phần dinh dưỡng thức ăn đậm đặc GD 26 Star Feed
STT Chỉ tiêu % Klg STT Chỉ tiêu % Klg 1. Độẩm tối thiểu 14% 5. NaCl 1 ÷ 1,3%
2. Canxi tối thiểu 3,5% 6. Năng lượng trao đổi 2100 kCal/Kg
3. Đạm tổng 39% 7. Chất xơ 9%
4. Phosphor 3,6 ÷ 4,2% 8. Kháng sinh Không có
2.4.3 Các nguyên liệu phối trộn thức ăn thí nghiệm 2.4.3.1 Bắp vàng, cám gạo, bột vỏ sò 2.4.3.1 Bắp vàng, cám gạo, bột vỏ sò
Bắp vàng, cám gạo, bột vỏ sò, muối do cơ sở thức ăn chăn nuôi ở số 69 đường Nguyễn Thị Nhỏ, Quận 6, TP. HCM cung cấp.
2.4.3.2 Bột cá
tư nhân chế biến bột cá Tân Tiến, TP. Vũng Tàu cung cấp.
2.4.4 Bố trí thí nghiệm trên đàn gà
Gà thí nghiệm được chia làm 6 lô, mỗi lô 40 con gồm 10 chuồng, mỗi chuồng 4 con. Khảo sát các chỉ tiêu năng suất trứng, khối lượng của gà thí nghiệm trước khi bắt đầu thí nghiệm. Gà ở các lô thí nghiệm được ăn thức ăn có thành phần như sau:
2.4.4.1 Lô đối chứng
Gà ở lô ĐC được ăn 100% thức ăn do doanh nghiệp Mai Thuỷ phối trộn. Thành phần thức ăn phối trộn gồm thức ăn đậm đặc GD26 Star Feed, bắp vàng xay, tấm, cám gạo, vỏ sò. Tỷ lệ (%) các thành phần thay đổi theo từng giai đoạn tuổi. Kết quả tính toán năng lượng và thành phần dinh dưỡng của thức ăn từ phầm mềm Ultramix như bảng 2.12 (xem phụ lục 5.18).
Bảng 2.12 Công thức thức ăn cho gà mái đẻở lô đối chứng
Lứa tuổi gà 19 ÷ 35 tuần tuổi 36 ÷ 50 tuần tuổi GD26 Star Feed (Kg) 35 31 Bắp (Kg) 30 30 Tấm (Kg) 20 23 Cám gạo (Kg) 8 9 Vỏ sò (Kg) 7 7 Tổng khối lượng (Kg) 100 100 Chất khô (%) 87,84 87,87 Protein thô (%) 18,19 18,00 Năng lượng ME (kCal/kg) 2 769 2 809 2.4.4.2 Lô thí nghiệm
Ở các lô thí nghiệm từ lô 1 đến lô 5, gà được ăn thức ăn hỗn hợp do chúng tôi xây dựng, khẩu phần đáp ứng nhu cầu 18% protein cho gà đẻ trứng nâu trong thời kỳ năng suất trứng cao. Thành phần phối trộn thức ăn gồm: bắp vàng, bã đậu nành, cám gạo, chế phẩm βCR, bột cá, bột vỏ sò, muối NaCl. Cốđịnh các thành phần cám gạo, bột cá,
muối NaCl và bột vỏ sò với tỷ lệ (%) như sau:
− Cám gạo (loại 12% đạm): 20% − Bột cá (loại 53% đạm): 5%
− NaCl: 0,5%
− Bột vỏ sò: 0,5%
Thay đổi tỷ lệ chế phẩm βCR sử dụng trong các lô 1 đến lô 5 lần lượt là 5, 10, 15, 20 và 25%. Từ tỷ lệ chế phẩm βCR sử dụng trong các lô, tiến hành tính toán thành phần cần phối trộn của bắp vàng, bã đậu nành và đề xuất thành phần thức ăn phối trộn cho gà ở các lô thí nghiệm.
Gà được nuôi trong cùng điều kiện nuôi trong chuồng (như nhiệt độ, ánh sáng). Kỹ thuật chuyển đổi thức ăn từ loại cũ sang loại mới phải từ từ, tránh thay thức ăn đột ngột. Lúc đầu, trộn ¼ thức ăn mới với ¾ loại cũ. Sau 4 ngày, thay đổi tỷ lệ là ½ mới và ½ cũ. Sau 8 ngày trộn ¾ mới với ¼ cũ [9]. Sau 2 tuần kế tiếp mới thay đổi hoàn toàn thức ăn mới. Việc thay đổi chậm này rất quan trọng giúp gia cầm tránh được bệnh tiêu chảy, hay các ảnh hưởng khác như giảm tăng trưởng, giảm sản lượng trứng và trứng sinh ra có vỏ mỏng [71]. Do đó, bắt đầu thực nghiệm khi gà được 26 tuần tuổi nhưng đến khi gà được 34, 38 và 42 tuần tuổi chúng tôi mới ghi nhận các số liệu khảo sát về năng suất và phẩm chất trứng.
Gà được theo dõi tình trạng sức khỏe hằng ngày, tiêm phòng đầy đủ. Cho gà ăn thức ăn hai lần/ngày vào 6 giờ sáng và 15 giờ 30 chiều. Lượng thức ăn dùng cho tất cả các lô là giống nhau và thay đổi tùy theo giai đoạn tuổi của gà.
2.4.5 Các chỉ tiêu khảo sát năng suất và phẩm chất trứng 2.4.5.1 Năng suất trứng 2.4.5.1 Năng suất trứng
a. Năng suất cho trứng
Số trứng ở mỗi lô được ghi nhận hằng ngày. Cuối tuần cộng lại rồi tính tỷ lệđẻ của tuần. Số trứng được tính chỉ gồm những trứng bình thường, không tính trứng vỏ lụa (nếu có) [8, 138].
Năng suất trứng (%) = Tổng số trứng trong tuần (quả) x 100 Tổng số gà theo dõi x số ngày theo dõi trong tuần
b. Khối lượng trứng
Cân từng quả trứng vào một ngày cố định trong tuần của tất cả các lô, sau đó tính khối lượng trứng trung bình [8].
2.4.5.2 Các chỉ tiêu về chất lượng trứng
Đánh giá chất lượng trứng sau khi sử dụng chế phẩm định kỳ sau một tháng thí nghiệm vào các tuần 34, 38 và 42 tuần tuổi. Phân tích đánh giá các chỉ tiêu về chất lượng trứng theo các phương pháp sau [138]:
a. Chỉ số hình dạng
Hình dạng trứng với một đầu tù và một đầu nhọn. Chỉ số hình dạng là chỉ số giữa chiều rộng và chiều dài của trứng. Trứng tốt có chỉ số hình dạng từ 0,75 ÷ 0,84.
Dùng thước kẹp có độ chính xác ± 0,1 mm đểđo chiều dài, chiều rộng của trứng.
b. Chỉ số Haugh
Độ nhớt của lòng trắng được đánh giá qua chỉ số Haugh. Trứng tươi, phẩm chất tốt có chỉ số Haugh cao, tức là lòng trắng có kết cấu của albumin chặt, khi đập trứng trên mặt kính phẳng, khối lòng trắng vun cao và gọn, khi đó chiều cao của lòng trắng đặc sẽ cao (như hình 2.4).
Hình 2.4 Trứng gà đập trên mặt phẳng kính
Do chỉ số Haugh biểu thị tương tác giữa chiều cao lòng trắng đặc và khối lượng trứng nên ngay sau khi đập trứng trên phiến kính, tiến hành đo chiều cao lòng trắng đặc
Chỉ số hình dạng = Kích thước chiều rộng (mm) Kích thước chiều dài (mm) Klg trứng trung bình (g) =
Tổng số trứng đã cân (quả) Tổng Klg trứng cân được (g)
bằng thước đo có đơn vị mm. Vị trí đo chiều cao lòng trắng đặc là chỗ lòng trắng đặc cao nhất. Sau đó, kết hợp với khối lượng ban đầu của trứng rồi tra bảng (xem phụ lục 5.14.1) suy ra chỉ số Haugh.
c. Màu lòng đỏ
Màu lòng đỏ trứng được đo bằng chiếc quạt so màu (Yolk Color Fan). Chiếc quạt này có 15 phiến màu, từ màu vàng xanh nhất đánh số 1 đến màu vàng đậm nhất đánh số 15. Trứng được đập ra trên một phiến kính phẳng lấy các phiến màu của quạt so trên lòng đỏ trứng. Bằng cách này có thểđo được màu lòng đỏ trứng. Trứng gà có màu lòng đỏ dưới 6 là lòng đỏ nhạt màu, màu của lòng đỏ trên 7 là tốt.
d. Tỷ lệ lòng đỏ
Đập trứng và nhẹ tay đổ khối trứng trên tấm kính vào rây lọc để lọc phần lòng trắng loãng. Trên rây còn lại phần lòng trắng đặc và lòng đỏ. Dùng cốc thủy tinh đã cân để biết khối lượng của cốc, tách lòng đỏ ra khỏi lòng trắng đặc, cân cốc thủy tinh có lòng đỏ. Khối lượng lòng đỏ là hiệu số giữa khối lượng cốc có lòng đỏ và khối lượng cốc. Làm tương tựđối với lòng trắng đặc.
e. Tỷ lệ lòng trắng đặc
Cân khối lượng lòng trắng trứng đặc và tính tỷ lệ lòng trắng trứng đặc theo công thức:
f. Tỷ lệ vỏ
Sau khi đập trứng, vỏ trứng được lau sạch phần nhớt còn sót lại bên trong, cân khối Tỷ lệ lòng trắng đặc (%) = Khối lượng trứng (g) Khối lượng lòng trắng đặc (g) x 100 Tỷ lệ lòng đỏ (%) = Khối lượng trứng (g) Khối lượng lòng đỏ (g) x 100 Hình 2.5 Quạt so màu lòng đỏ trứng
lượng vỏ và tính tỷ lệ vỏ như sau:
g. Độ dày vỏ
Độ dày vỏ được đo bằng thước vi cấp và lấy trung bình cộng của ba vị trí đầu tù, đầu nhọn và vùng xích đạo của vỏ trứng. Độ dày vỏđược tính luôn cả vỏ lụa [106].
h. Xác định hàm lượng vitamin A và beta-carotene trong lòng đỏ trứng
Nhặt tất cả trứng của mỗi lô, khảo sát các chỉ tiêu về chất lượng trứng của 30 trứng trong mỗi lô. Lấy lòng đỏ xác định hàm lượng vitamin A và beta-carotene trong trứng tươi của 3 đợt lấy mẫu khi gà được 34, 38, 42 tuần tuổi. Xác định hàm lượng beta- carotene và vitamin A có trong lòng đỏ theo phương pháp AOAC 958.05 và 974.29 [103].
Kiểm chứng kết quả (xem phụ lục 5.17): nhặt ngẫu nhiên mỗi lô ba trứng gửi trứng tươi đến Trung tâm Đào tạo và Phát triển sắc ký TP. HCM (số 79 Trương Định Q.1, TP. HCM) phân tích hàm lượng beta-carotene và vitamin A trong lòng đỏ trứng.
2.4.5.3 Lượng thức ăn tiêu thụ hằng ngày
Gà được cho ăn 2 lần/ngày, thức ăn được cân riêng 2 Kg/túi cho từng lô. Cuối tuần