1.2.5.1 Ảnh hưởng của nguồn giống
Trong công nghệ lên men, chủng giống vi sinh vật là vấn đề rất quan trọng. Đặc biệt với nấm men Rhodotorula là giống có khả năng sinh tổng hợp carotenoid không giống nhau giữa các chủng giống (xem bảng 1.2). Khả năng này phụ thuộc rất nhiều vào đặc tính di truyền của chủng giống dùng trong nghiên cứu [116].
Ngoài đặc tính di truyền của chủng giống, quá trình nuôi cấy vi sinh vật còn phụ thuộc nhiều vào các yếu tố dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy. Tuy nhiên nhưđã đề cập ở trên, từ trước đến nay nấm men Rhodotorula được nghiên cứu nhiều theo kỹ thuật lên men chìm, rất ít nghiên cứu đã công bố về khả năng phát triển trên môi trường rắn của nấm men này. Do đó trên cơ sở tài liệu hiếm hoi thu được từ các quá trình nuôi cấy bán rắn, chúng tôi tổng kết sơ lược các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men chìm của nấm men Rhodotorula như sau:
1.2.5.2 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng
- Ảnh hưởng của nguồn carbon
Theo Martin (1993) [100], thành phần môi trường để vi sinh vật sinh tổng hợp sắc tố không phụ thuộc vào việc nuôi cấy nhằm mục đích trích ly sắc tố hay thu sinh khối cực
đại. Tuy nhiên cũng có nhiều công bố cho rằng nguồn carbon ảnh hưởng rất lớn đến khả năng phát triển, khả năng tổng hợp sắc tố, đến thành phần sắc tố và thành phần các acid béo của nấm men Rhodotorula [14, 48, 66]. Theo Müncnerová D. và Augustín J. nhiều loài thuộc giống Rhodotorula có thể sử dụng được nguồn carbon là benzoate [109] hay glycerol [99].
Rhodotorula có khả năng sử dụng nhiều nguồn hydrocarbon mạch dài [91, 122], cũng như dễ dàng đồng hóa nguồn glucid từ các phế phụ phẩm của ngành công, nông nghiệp thực phẩm [14] như: bột mì, bột bắp, dịch chiết bột đậu nành, dịch chiết bột ngô [37-39, 144], nước sữa tách ra từ công nghệ sản xuất pho mát [55-57, 136], nước muối dưa cải [135], nước chiết than bùn [100], rỉ đường mía [27], rỉđường củ cải [87], nước ép nho [38].
Như vậy, nấm men Rhodotorula có khả năng sử dụng nhiều nguồn glucid khác nhau. Đặc biệt là khả năng sử dụng nguồn carbon mạch dài và thực tế Jacob (1991) đã dùng cám mì để LBR nấm men Rhodotorula gracilis [80]. Đây chính là cơ sở để chúng tôi chọn gạo tấm đã qua hồ hoá (có bổ sung dưỡng chất) để làm cơ chất chính cho quá trình LBR nấm men nghiên cứu.
- Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Nguồn nitơ có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula và sự ảnh hưởng này còn tùy thuộc vào khả năng sử dụng các nguồn nitơ của từng chủng giống [89]. Theo Khaled M. và cộng sự (1990) hai nguồn nitơ vô cơ có ảnh hưởng lớn đến khả năng tổng hợp carotenoid tổng của Rhodotorula là NH4NO3 và (NH4)2SO4. Khi Rhodotorula sử dụng nitơ ở dạng NH4+ sẽ kích thích quá trình tích lũy sinh khối cực đại. Trong khi đó, nếu nitơ ở dạng NO3- thì sẽ cho hiệu suất thu hồi sinh khối chỉ ở mức trung bình nhưng hàm lượng carotenoid tổng (theo Klg sinh khối khô) tăng lên rất lớn [87]. Ngược lại, nguồn nitơ hữu cơ như: glycine, valine, asparagine và leucine không ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp carotenoid [129]. Tỷ lệ C/N thích hợp cho nấm men Rhodotorula từ 30 ÷ 50 [66, 129, 147].
- Ảnh hưởng của khoáng chất
Giống nấm men Rhodotorula thích hợp với môi trường nước biển [24] và môi trường muối kim loại kiềm [88]. Một số loài nấm men thuộc giống Rhodotorula bị ức chếở nồng độ muối trên 5%, trong trường hợp này khả năng lên men của các nấm men càng thấp khi ở nồng độ muối càng cao [122]. Theo Bhosale P. và Grade R.V. [29], chủng đột biến Rh. glutinis mutant 32 cần được cung cấp thêm K2HPO4, KH2PO4 và MgSO4.7H2O vào môi trường. Tuy nhiên, thực tế nguồn khoáng cần bổ sung vào môi trường dinh dưỡng phụ thuộc nhiều vào nguồn cơ chất [87].
- Ảnh hưởng của các chất khác
Ngoài các nguồn dinh dưỡng chính như carbon, nitơ và khoáng chất thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy giống như nhiều quá trình nuôi cấy các sinh vật khác, các nấm men dầu cần bổ sung thêm các nguyên liệu chứa chất béo (gồm các loại dầu và các acid béo) để tích luỹ chất béo [89]. Khaled M. và cộng sự cho rằng các loại dầu thực vật như dầu hạt bông, dầu ôliu, dầu bắp và dầu thầu dầu đều làm tăng đáng kể khả năng tổng hợp chất béo, trong đó dầu hạt bông được xem là có tác dụng cao nhất [87]. Bên cạnh đó, một số chất được ghi nhận có tác dụng làm tăng hàm lượng carotenoid như:
- Phenol với nồng độ 500 ppm làm tăng hàm lượng beta-carotene lên đến 35%, giảm lượng torularhodin trong khi hàm lượng torulene hầu như không đổi [33].
- 2-(4-chlorophenyl)- triethylamine (CPTA) có tác dụng kích thích quá trình chuyển hóa vòng của các carotenoid như quá trình tạo vòng trực tiếp từ lycopene thành λ- carotene dẫn đến tăng hàm lượng beta-carotene [73].
1.2.5.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy
- Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nấm men Rhodotorula thường phát triển ở nhiệt độ 25 ÷ 30oC và khoảng nhiệt độ thích hợp là 27 ÷ 28oC [19]. Ở nhiệt độ 30oC, nếu có chiếu sáng vào cuối giai đoạn tăng trưởng logarith sẽ làm tăng lượng beta-carotene đồng thời giảm lượng torulene và
torularhodin. Khi hạ nhiệt độ từ 30oC xuống 25oC hàm lượng beta-carotene thu được tăng cao như ở bảng 1.3. Ở nhiệt độ 40oC, nấm men Rhodotorula hầu như không phát triển [89, 91, 129]. Sau đây là một kết quả minh hoạ:
Bảng 1.3 Sắc tố carotenoid do Rho. glutinis DBVPG 3853 tổng hợp được sau 120 giờ
trên môi trường nước ép nho ở các nhiệt độ khác nhau [38]
Nhiệt độ (oC) Carotenoid tổng (mg/l ) Carotenoid tổng (µg/g tế bào khô) Các sắc tố carotenoid (% carotenoid tổng)
β-carotene Torulene Torularhodin
25 4,99 831,7 16,0 18,0 60,1
30 5,95 915,4 9,3 9,4 78,9
35 5,08 736,2 5,9 9,8 78,7
- Ảnh hưởng của pH
Giống như các vi sinh vật khác pH thích hợp cho sự phát triển của nấm men
Rhodotorula khác nhau tùy từng loài, chủng. Giá trị pH thích hợp cho Rhodotorula
thông thường ở khoảng pH hơi acid từ pH 5 đến 6. Tuy nhiên, giá trị pH này còn phụ thuộc vào thành phần môi trường và nhiệt độ nuôi cấy [109].
- Ảnh hưởng của ánh sáng
Ánh sáng có ảnh hưởng đáng kểđến khả năng hình thành carotenoid cũng như thành phần carotenoid của nấm men [89]. Toàn bộ quá trình sinh tổng hợp sắc tố carotenoid của nấm men có thể chia thành 3 giai đoạn: giai đoạn cảm ứng ánh sáng (tối thiểu 12 giờ), giai đoạn tổng hợp các enzyme (giai đoạn này xảy ra trong tối) và giai đoạn tổng hợp carotenoid phụ thuộc vào ánh sáng [129]. Tuy nhiên, theo Tada Mikiro (1982) [144] mức độ hình thành carotenoid phụ thuộc vào cường độ chiếu sáng và qua hai giai đoạn. Giai đoạn đầu xảy ra phản ứng quang hóa không phụ thuộc vào nhiệt độ nhưng rất cần ánh sáng và giai đoạn thứ hai xảy ra các phản ứng hóa sinh không phụ thuộc vào ánh sáng. Thực tế, cường độ chiếu sáng có liên quan đến nhiệt độ nuôi cấy. Khi nuôi nấm men Rhodotorula ở nhiệt độ 30oC, hàm lượng beta-carotene giảm đáng kể nhưng nếu nấm men được chiếu sáng vào cuối giai đoạn phát triển logarith kết quả
lượng beta-carotene sẽ tăng 58% so với khi không chiếu sáng. Ngược lại, nuôi cấy ở nhiệt độ thấp (khoảng 20oC), hàm lựơng beta-carotene thu được khi nấm men được và không được chiếu sáng tăng (chênh lệch) không đáng kể [129].
- Ảnh hưởng của oxi
Quá trình tổng hợp carotenoid rất cần đến sự tạo thành của các hợp chất có tính oxi hóa cao do đó rất cần oxi [20]. Không khí đóng vai trò rất quan trọng, có liên quan đến sự hình thành sắc tốở nấm men và các vi sinh vật khác [35, 152]. Không khí còn có vai trò trong việc phân chia thành từng vùng của sắc tố trong quá trình sinh tổng hợp carotenoid của tế bào sinh vật [63]. Như vậy, quá trình sinh trưởng của Rhodotorula rất cần đến không khí, vì ngoài việc cung cấp oxi giúp tế bào hô hấp nó còn giữ vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp carotenoid của nấm men.