a. Năng suất cho trứng
Số trứng ở mỗi lô được ghi nhận hằng ngày. Cuối tuần cộng lại rồi tính tỷ lệđẻ của tuần. Số trứng được tính chỉ gồm những trứng bình thường, không tính trứng vỏ lụa (nếu có) [8, 138].
Năng suất trứng (%) = Tổng số trứng trong tuần (quả) x 100 Tổng số gà theo dõi x số ngày theo dõi trong tuần
b. Khối lượng trứng
Cân từng quả trứng vào một ngày cố định trong tuần của tất cả các lô, sau đó tính khối lượng trứng trung bình [8].
2.4.5.2 Các chỉ tiêu về chất lượng trứng
Đánh giá chất lượng trứng sau khi sử dụng chế phẩm định kỳ sau một tháng thí nghiệm vào các tuần 34, 38 và 42 tuần tuổi. Phân tích đánh giá các chỉ tiêu về chất lượng trứng theo các phương pháp sau [138]:
a. Chỉ số hình dạng
Hình dạng trứng với một đầu tù và một đầu nhọn. Chỉ số hình dạng là chỉ số giữa chiều rộng và chiều dài của trứng. Trứng tốt có chỉ số hình dạng từ 0,75 ÷ 0,84.
Dùng thước kẹp có độ chính xác ± 0,1 mm đểđo chiều dài, chiều rộng của trứng.
b. Chỉ số Haugh
Độ nhớt của lòng trắng được đánh giá qua chỉ số Haugh. Trứng tươi, phẩm chất tốt có chỉ số Haugh cao, tức là lòng trắng có kết cấu của albumin chặt, khi đập trứng trên mặt kính phẳng, khối lòng trắng vun cao và gọn, khi đó chiều cao của lòng trắng đặc sẽ cao (như hình 2.4).
Hình 2.4 Trứng gà đập trên mặt phẳng kính
Do chỉ số Haugh biểu thị tương tác giữa chiều cao lòng trắng đặc và khối lượng trứng nên ngay sau khi đập trứng trên phiến kính, tiến hành đo chiều cao lòng trắng đặc
Chỉ số hình dạng = Kích thước chiều rộng (mm) Kích thước chiều dài (mm) Klg trứng trung bình (g) =
Tổng số trứng đã cân (quả) Tổng Klg trứng cân được (g)
bằng thước đo có đơn vị mm. Vị trí đo chiều cao lòng trắng đặc là chỗ lòng trắng đặc cao nhất. Sau đó, kết hợp với khối lượng ban đầu của trứng rồi tra bảng (xem phụ lục 5.14.1) suy ra chỉ số Haugh.
c. Màu lòng đỏ
Màu lòng đỏ trứng được đo bằng chiếc quạt so màu (Yolk Color Fan). Chiếc quạt này có 15 phiến màu, từ màu vàng xanh nhất đánh số 1 đến màu vàng đậm nhất đánh số 15. Trứng được đập ra trên một phiến kính phẳng lấy các phiến màu của quạt so trên lòng đỏ trứng. Bằng cách này có thểđo được màu lòng đỏ trứng. Trứng gà có màu lòng đỏ dưới 6 là lòng đỏ nhạt màu, màu của lòng đỏ trên 7 là tốt.
d. Tỷ lệ lòng đỏ
Đập trứng và nhẹ tay đổ khối trứng trên tấm kính vào rây lọc để lọc phần lòng trắng loãng. Trên rây còn lại phần lòng trắng đặc và lòng đỏ. Dùng cốc thủy tinh đã cân để biết khối lượng của cốc, tách lòng đỏ ra khỏi lòng trắng đặc, cân cốc thủy tinh có lòng đỏ. Khối lượng lòng đỏ là hiệu số giữa khối lượng cốc có lòng đỏ và khối lượng cốc. Làm tương tựđối với lòng trắng đặc.
e. Tỷ lệ lòng trắng đặc
Cân khối lượng lòng trắng trứng đặc và tính tỷ lệ lòng trắng trứng đặc theo công thức:
f. Tỷ lệ vỏ
Sau khi đập trứng, vỏ trứng được lau sạch phần nhớt còn sót lại bên trong, cân khối Tỷ lệ lòng trắng đặc (%) = Khối lượng trứng (g) Khối lượng lòng trắng đặc (g) x 100 Tỷ lệ lòng đỏ (%) = Khối lượng trứng (g) Khối lượng lòng đỏ (g) x 100 Hình 2.5 Quạt so màu lòng đỏ trứng
lượng vỏ và tính tỷ lệ vỏ như sau:
g. Độ dày vỏ
Độ dày vỏ được đo bằng thước vi cấp và lấy trung bình cộng của ba vị trí đầu tù, đầu nhọn và vùng xích đạo của vỏ trứng. Độ dày vỏđược tính luôn cả vỏ lụa [106].
h. Xác định hàm lượng vitamin A và beta-carotene trong lòng đỏ trứng
Nhặt tất cả trứng của mỗi lô, khảo sát các chỉ tiêu về chất lượng trứng của 30 trứng trong mỗi lô. Lấy lòng đỏ xác định hàm lượng vitamin A và beta-carotene trong trứng tươi của 3 đợt lấy mẫu khi gà được 34, 38, 42 tuần tuổi. Xác định hàm lượng beta- carotene và vitamin A có trong lòng đỏ theo phương pháp AOAC 958.05 và 974.29 [103].
Kiểm chứng kết quả (xem phụ lục 5.17): nhặt ngẫu nhiên mỗi lô ba trứng gửi trứng tươi đến Trung tâm Đào tạo và Phát triển sắc ký TP. HCM (số 79 Trương Định Q.1, TP. HCM) phân tích hàm lượng beta-carotene và vitamin A trong lòng đỏ trứng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.4.5.3 Lượng thức ăn tiêu thụ hằng ngày
Gà được cho ăn 2 lần/ngày, thức ăn được cân riêng 2 Kg/túi cho từng lô. Cuối tuần cân lượng thức ăn còn dư lại trong máng. Từđó tính lượng thức ăn tiêu thụ hằng ngày như sau:
2.4.5.4 Tỷ lệ sống
Tỷ lệ sống của gà được đánh giá qua chỉ tiêu tỷ lệ nuôi sống. Tỷ lệ sống qua các giai đọan khảo sát được tính theo tỷ lệ % số gà còn sống so với số gà ban đầu [9].
2.4.6 Quan sát sự tiêu huỷ của tế bào nấm men Rhodotorula
Khảo sát sự tiêu huỷ của tế bào Rhodotorula trong hệ tiêu hoá của gà bằng cách Tỷ lệ vỏ (%) =
Khối lượng trứng (g) Khối lượng vỏ (g)
x 100
Lượng thức ăn tiêu thụ hằng ngày (g) =
Tổng số gà có mặt trong tuần Tổng lượng thức ăn trong tuần (g) Tỷ lệ nuôi sống (%) = Tổng số gà lúc bắt đầu thí nghiệm (con) Tổng số gà lúc kết thúc thí nghiệm (con) x 100
quan sát sự hiện diện của tế bào nấm men Rhodotorula trong phân của gà ăn thức ăn thí nghiệm và thức ăn đối chứng. Quan sát tế bào chết dưới kính hiển vi bằng cách nhuộm tiêu bản với xanh methylene và tế bào khuẩn lạc nấm men Rhodotorula sống trên thạch đĩa. Thể thức quan sát: nếu trong phân không có sự hiện diện của tế bào nấm men
Rhodotorula chứng tỏ chúng đã bị tiêu huỷ trong hệ tiêu hóa gà.
2.4.7 Xác định mối tương quan giữa tổng hàm lượng carotenoid trong thức ăn với năng suất cho trứng của gà
Trên cơ sở tính toán năng lượng, hàm lượng protein tổng và hàm lượng carotenoid có trong các lô thí nghiệm bằng phần mềm Ultramix, chúng tôi so sánh, biện luận để tìm ra mối quan hệ giữa hàm lượng carotenoid tổng với năng suất cho trứng của gà Isa
Brown trong giai đoạn gà cho trứng cao và ổn định.
2.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Để kết quả thu nhận được chính xác, các thí nghiệm sẽđược thực hiện 3 lần để lấy kết quả trung bình và tính sai số qua công cụ phân tích Data Analysis của phần mềm Microsoft Office Excel.
Phương pháp tối ưu quay bậc hai của Box-Hunter và phương pháp tối ưu toàn phần các yếu tố lần lượt được áp dụng để xác định các thông số tối ưu của quá trình LBR. Các hệ số hồi qui được kiểm tra bằng tiêu chuẩn Student, sự tương thích của phương trình hồi qui với thực nghiệm được kiểm tra bằng tiêu chuẩn Fisher.
Các số liệu mô tả các biến số khảo sát trên chuột và gà tuân theo luật phân phối chuẩn gồm giá trị trung bình kèm theo độ lệch chuẩn (standard deviation) với mức ý nghĩa α = 0,05.
So sánh sự sai khác giữa các nghiệm thức thí nghiệm dùng công cụ Compare của phần mềm thống kê Statgraphics Plus.
Tối ưu hoá bằng công cụ Optimizer của phần mềm Modde 5.0.
Tính toán năng lượng và công thức thức ăn bằng phần mềm Ultramix. Vẽđồ thị trên phần mền Orgin 6.0 và phần mềm Microsoft Office Excel.
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1 KẾT QUẢ CHỌN RHODOTORULA CÓ KHẢ NĂNG CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BETA-CAROTENE TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN
3.1.1 Phân lập các nấm men sinh sắc tố carotenoid
Chúng tôi đã phân lập từ 64 mẫu (trong đó có 21 mẫu lá; 17 mẫu hoa, vỏ quả; 10 mẫu đất cát; 3 mẫu nước; 3 mẫu rác và 10 mẫu thực phẩm) có nguồn gốc như bảng 2.1. Mỗi mẫu lần lượt được phân lập trên các môi trường YMPG, YPG và PGA (xem thành phần ở mục 2.1.2). Trong từng trường hợp, chọn các khuẩn lạc đặc trưng có màu từ vàng, cam đến đỏ. Sau khi làm thuần và quan sát các đặc điểm hình thái tế bào dưới kính hiển vi, chúng tôi đã tuyển chọn được 17 dòng nấm men sinh sắc tố từ có màu từ vàng kem, hồng cam đến đỏ. Các nấm men này được ký hiệu lần lượt là MN1, MN2, MN3, MN4, MN5, MN6, MN7, MN8, MN9, MN10, MN11, MN12, MN13, MN14, MN15, MN16 và MN17 (hình 3.1).
Hình 3.1 Các nấm men sinh sắc tố carotennoid phân lập được (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.1.2 Chọn và định danh các nấm men thuộc giống Rhodotorula trên cơ sở thực hiện các thí nghiệm theo khoá phân loại của Kreger-van Rij
3.1.2.1 Chọn giống nấm men Rhodotorula
Tiến hành thực hiện các phản ứng sinh lý, sinh hóa đối với 17 nấm men sinh sắc tố carotenoid phân lập được ở trên để trả lời các câu hỏi trong việc định danh nhóm các giống nấm men tạo bào tử và không tạo bào tử theo khoá phân loại của Kreger-van Rij
(1984). Kết quả chúng tôi đã chọn được 8 chủng nấm men mang ký hiệu MN1, MN5, MN7, MN8, MN10, MN12, MN16 và MN17 thuộc giống Rhodotorula (khoá định danh nấm men đến giống của Kreger-van Rij, xem phụ lục 5.1.4) như hình 3.2
Hình 3.2 Giống nấm men Rhodotorula phân lập được
Hình thái tế bào và tốc độ phát triển của 8 chủng Rhodotorula phân lập được vào ngày nuôi cấy thứ 8 trên thạch đĩa được mô tảở bảng 3.1.
Bảng 3.1 Đặc điểm tế bào và tốc độ phát triển của 8 chủng phân lập được
Đặc điểm Ký hiệu Nguồn phân lập Hình thái tế bào Mô tả khuẩn lạc Tốc độ phát triển (mm) MN 1 Đất vườn Hình dài
Màu hồng cam hay đỏ cam, bề mặt nhẵn, bóng sáng, mép không có răng cưa, tâm khuẩn lạc nhô lên.
7 ÷ 10
MN 5 Vỏ táo Hình tròn
Màu hồng hay cam, to, tròn bề mặt khuẩn lạc mịn, nhẵn bóng, mép không răng cưa, dày. 10 ÷ 20 MN 7 Nước biển VT Hình tròn cầu
Màu vàng kem hay hồng cam, tròn, bề mặt khô mịn, mờ đục, mép không răng cưa, khuẩn lạc nhô lên ở tâm.
5 ÷ 15 MN 8 Mía bệnh đốm đỏ Hình tròn
Màu cam đến đỏ cam, to tròn, bề mặt gồ ghề, xếp mí, mép không có răng cưa, tâm khuẩn lạc dày đặc các nếp gấp.
MN 10 Lá dâm bụt Hình dài
Màu hồng cam hay đỏ, to, tròn nhẵn bóng, nhiều nhớt, mép không có răng cưa, khuẩn lạc tương đối dày như nhau tại tâm cũng như gần mép. 8 ÷ 14 MN 12 Lá lúa LA Hình trứng
Màu cam hay đỏ cam, to tròn, bề mặt khô nhẵn, mép không có răng cưa, bề dày khuẩn lạc trung bình. 12 ÷ 17 MN 16 Vỏ dưa lê Hình elip kéo dài
Màu cam hay đỏ, to tròn đôi khi gồ ghề, bề mặt hơi khô, xếp nhiều nếp, mép không có răng cưa, khuẩn lạc mỏng. 8 ÷ 13 MN 17 Hoa dâm bụt Hình tròn cầu
Màu cam, to hình ovan, bề mặt khô, mịn , mép khuẩn lạc không có răng cưa, khuẩn lạc mỏng hơi nhô lên ở tâm.
7 ÷ 12
3.1.2.2 Khảo sát các đặc điểm sinh hóa và định danh loài của 8 chủng nấm men
Rhodotorula phân lập được
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát đặc điểm sinh lý và sinh hóa của 8 chủng Rhodotorula phân lập được
Số
TT Thí nghiệm thực hiện
Ký hiệu nấm men Rhodotorula phân lập được
MN1 MN5 MN7 MN8 MN10 MN12 MN16 MN17 1. Nang bào tử - - - - 2. Sự tiếp hợp - - - - 3. Giả sợi nấm - - - - 4. Khuẩn ty thể - - - - 5. Bào tử bắn - - - - 6. Urease + + + + + + + + 7. DBB (diazonium blue B) + + + + + + + + 8. Phát triển ở 200C + + + + + + + + 9. Phát triển ở 300C + + - - + + - -/+ 10. Phát triển ở 370C - - - - - - - -
11. Lên men glucose - - - -
12. Hình thành hợp chất tinh bột - - - - (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
14. D-galactose + + + + + + + + 15. Lactose - - - - 16. Sucrose + + + + + + + + 17. Maltose + - + - + + - + 18. Cellobiose + + - - - V 19. D-xylose + + + + + + + + 20. L-Arabinose - - - - 21. D-Trehalose + + - - - - 22. Melezitose + - + - + + - + 23. Raffinose V + + - + + - + 24. L-Arabitol - + - - - - 25. Glycerol + + + + + + + + 26. Melibiose - - - + - - 27. Inositol - - - - 28. Potassium nitrate + + + - + + - +
Ghi chú: (-): phản ứng âm tính; (+): phản ứng dương tính; V(-/+): phản ứng yếu, không rõ.
Tiến hành khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các nấm men Rhodotorula
phân lập được trên bộ Test ID32E và trên các môi trường phân lập ở thạch đĩa và trong ống nghiệm (xem hình ở phụ lục 5.16.1). Các kết quảđược trình bày ở bảng 3.2.
Kết hợp quan sát các đặc điểm hình thái sinh lý tế bào, khuẩn lạc và các đặc điểm sinh hóa của các nấm men thuộc giống Rhodotorula và căn cứ vào khóa định danh của Kreger-van Rij, chúng tôi kết luận như sau:
- Nấm men ký hiệu MN5 là Rh. graminis; - Nấm men ký hiệu MN7 là Rh. ingeniosa;
- Hai chủng MN10 và MN17 đều là Rh. glutinis nên được ký hiệu lần lượt là Rh.
glutinis HUI-1 và Rh. glutinis HUI-2;
- Bốn nấm men có ký hiệu MN1, MN8, MN12 và MN16 chưa đủ cơ sở để định danh đến loài nên chúng được ký hiệu lần lượt là: Rhodotorula sp.1 (MN1),
3.1.3 Chọn chủng nấm men nghiên cứu chính từ các chủng phân lập được trên cơ sở khả năng sinh tổng hợp beta-carotene
Cấy cùng tỷ lệ giống khoảng 2 x 107 CFU/g môi trường và tiến hành LBR 8 loại nấm men Rhodotorula phân lập được trong cùng điều kiện. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của chúng ở ngày lên men thứ 7 trên môi trường cơ bản (xem mục 2.2.2.1), kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của các chủng nấm men Rhodotorula trên môi trường cơ bản
Ký hiệu nấm men Hàm lượng beta-carotene (ppm theo CK)
MN1 14,48 ± 3,81c MN5 27,77 ± 7,03 b MN7 3,98 ± 0,97 d MN8 4,42 ± 1,43d MN10 16,70 ± 2,18 c MN12 42,55 ±±±± 3,57 a MN16 5,10 ± 2,06 d MN17 2,46 ± 0,42 d
(Các giá trị có chỉ số mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa ở mức α = 0,05)
Kết quả thí nghiệm cho thấy, bốn nấm men có ký hiệu MN7, MN8, MN16 và MN17 hầu như không phát triển trên môi trường cơ bản đã chọn. Bốn chủng giống có ký hiệu MN1, MN5, MN10 và MN12 có khả năng LBR và sinh tổng hợp beta-carotene trên môi trường cơ bản, tuy nhiên hàm lượng beta-carotene do bốn chủng nấm men này tổng hợp không giống nhau và khác biệt ở mức ý nghĩa α = 0,05.
Thực nghiệm khảo sát khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của 8 chủng nấm men
Rhodotorula phân lập được trình bày ở bảng 3.3. Bảng 3.3 cho thấy MN12 là nấm men có khả năng sinh tổng hợp beta-carotene cao nhất (xem kết quả phân tích bằng kỹ thuật HPLC ở phụ lục 5.7.1 và phân tích anova ở phụ lục 5.7.2), do đó MN12 được chọn làm chủng giống nghiên cứu chính. Bên cạnh phương pháp định danh dựa vào các đặc điểm
sinh lý, sinh hóa theo khoá phân loại của Kreger-van Rij (1984) chúng tôi cũng gửi mẫu nấm men MN12 đến Công ty Nam Khoa đểđịnh danh.
Bằng phương pháp giải trình tự 28S DNA và tra cứu trên blast search, kết quảđịnh danh nấm men MN12 thu được như sau:
- Trật tự sắp xếp các nucleotid có kết quả:
Hình 3.3 Trình tự nucleotid đoạn 28S DNA
Hình 3.4 Giải trình tự 28S DNA của chủng MN12
- Tra cứu trên bằng phần mềm blast search:
Hình3.5 Kết quả tra cứu trình tự 28S DNA của chủng MN12
Qua việc giải trình tự 28S DNA và tra cứu trên blast search, cho kết quả với độ tương đồng 100% với chủng Rhodotorula sp. CBS 10104 trong dữ liệu ngân hàng NCBI (xem phụ lục 5.8). Vậy trong luận án này, để thuận lợi cho việc trình bày chúng
tôi thống nhất gọi nấm men Rhodotorula sp.3 (MN12) là Rhodotorula.
3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ
RHODOTORULA THEO PHƯƠNG PHÁP BÁN RẮN
3.2.1 Khảo sát các phương pháp phá vỡ thành tế bào nấm men (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.2.1.1 Khảo sát hệ dung môi trích ly và bước sóng cho độ hấp thu cực đại
Tiến hành thí nghiệm khảo sát hệ dung môi trích ly và bước sóng tại đó dung dịch