Vấn đề khó khăn thường gặp trong kỹ thuật LBR là quá trình khuấy trộn môi trường, trao đổi nhiệt, thông khí và quá trình kiểm soát độẩm, độ pH. Đây chính là các yếu tố làm cho LBR có phần nào hạn chế khi đưa ra ứng dụng theo quy mô công nghiệp [107].
1.2.2.1 Ảnh hưởng của độẩm và hoạt độ nước
Lượng nước sử dụng trong LBR rất thấp. Điều này có ý nghĩa thực tiễn cao trong công nghiệp do giảm được lượng nước thải rất nhiều so với lên men chìm [118]. Trong LBR, có thể xem sự tăng trưởng và phát triển của vi sinh vật trên cơ chất rắn không có sự hiện diện của nước tự do. Nước trong hệ thống tồn tại ở dạng liên kết với cơ chất hoặc ở dạng liên kết hấp phụ hay liên kết mao quản trong cơ chất. Độ ẩm trong LBR ảnh hưởng lớn đến sự tăng trưởng của vi sinh vật. Không có mức độ ẩm tối ưu cho tất cả các loại cơ chất và vi sinh vật. Thông thường độ ẩm thay đổi từ 30 ÷ 85% [151]. Trong LBR, hàm lượng nước tối ưu của môi trường cơ chất mà vi sinh vật phát triển được thể hiện bằng thông số hoạt độ (water activity- aW). Việc giảm aW sẽ ảnh hưởng đến tăng trưởng của vi sinh vật, pha lag kéo dài, giảm tỷ lệ tăng trưởng và cuối cùng là hàm lượng sinh khối thu được sẽ thấp (Oriol và cộng sự, 1988) [113].
1.2.2.2 Nhu cầu oxi
Trong LBR, việc đảm bảo sự thoáng khí nhằm duy trì điều kiện hiếu khí, đẩy khí CO2 ra khỏi môi trường, duy trì nhiệt độ cho môi trường cơ chất và điều hòa độ ẩm.
Điều kiện này ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh tổng hợp sinh khối, enzyme và đặc biệt là sắc tố đối với các vi sinh vật sinh tổng hợp sắc tố. Do cơ chất ở trạng thái rắn nên oxi trong không khí được lưu chuyển và khuếch tán đến bề mặt của chúng một cách dễ dàng. Việc sục khí trong LBR sẽ làm tăng khả năng khuếch tán của không khí vào môi trường cơ chất nhằm đảm bảo việc cung cấp oxi. Khi cung cấp không khí vào hệ thống lên men bề mặt thì thành phần khí khi đi vào và đi ra khỏi hệ thống được mô tả như hình 1.7 [107].
Hình 1.7 Thành phần thể tích của dòng khí đi vào và đi ra trong lên men bán rắn [107]
1.2.2.3 Nhiệt độ và sự truyền nhiệt
Nhiêt độ là yếu tốảnh hưởng quan trọng đến quá trình LBR. Do đó việc làm giảm nhiệt độ của cơ chất trong quá trình LBR ở quy mô công nghiệp là nhiệm vụ rất cần thiết. Do cơ chất rắn có khả năng truyền nhiệt kém nên khi vi sinh vật phát triển sẽ tạo ra một gradient về nhiệt. Khi cơ chất rắn tích tụ nhiệt sẽ làm tăng hàm lượng ẩm và gây khó khăn cho quá trình truyền nhiệt. Vấn đề duy trì nhiệt và hàm lượng ẩm ổn định trong LBR ở quy mô công nghiệp đang là bài toán nan giải trong kỹ thuật. Tuy nhiên, người ta cũng có thể thực hiện được với các thiết bị chuyên dùng đặc biệt [107, 151].
1.2.3 Phương pháp định lượng sinh khối trong lên men bán rắn
Việc nghiên cứu động học của hệ thống LBR là vấn đề rất phức tạp. Trong LBR tồn tại hỗn hợp gồm 3 pha: pha rắn (chất hữu cơ, khoáng chất hay các chất tổng hợp), pha chìm và pha khí. Vi sinh vật hiện diện trong cả 3 pha này (Durand và Chereau, 1988) [52]. Do đó, khác với lên men chìm, việc xác định trực tiếp sinh khối của quá trình
LBR sẽ rất khó khăn do gặp trở ngại trong việc tách vi sinh vật ra khỏi môi trường không đồng nhất. Dưới đây chúng tôi trình bày một số phương pháp xác định sinh khối của quá trình LBR.
1.2.3.1 Phương pháp xác định sinh khối trực tiếp
Trong LBR các vi sinh vật thuộc nhóm đơn bào, ta có thể dùng phương pháp xác định sinh khối trực tiếp. Do tế bào không bám sâu vào cơ chất rắn nên ta dễ dàng tách chúng ra khỏi cơ chất rắn bằng cách trộn vào nước, sau đó dùng các phương pháp cổ điển (phương pháp xác định tổng số tế bào, khuẩn lạc, …) để xác định sinh khối (Sato và cộng sự, 1985). Tuy nhiên đối với quá trình LBR, không có phương pháp xác định sinh khối trực tiếp dựa vào đường chuẩn [52].
1.2.3.2 Phương pháp xác định sinh khối gián tiếp
Hiện nay, các nhà khoa học đã công bố nhiều phương pháp gián tiếp khác nhau để xác định sinh khối bằng cách phân tích các yếu tố trung gian như:
- Glucosamine (glucosamine từ chitin, Narahara và cộng sự, 1982) [112]; - Ergosterol (Seitz và cộng sự, 1979) [133];
- Acid nucleic (Koliander và cộng sự, 1984) [90];
- Tốc độ hình thành CO2 (Narahara và cộng sự, 1982) [112];
- Hàm lượng carbohydrat tổng hay nitơ tổng xác định theo phương pháp Micro Kjeldahl [52].
Nếu vi sinh vật nuôi cấy có nhiều glucosamine và ergosterol, người ta thường dùng hai phương pháp đầu bằng cách xác định glucosamine, ergosterol theo phương pháp so màu [52]. Tuy nhiên phương pháp này có nhược điểm là mẫu lấy phân tích phải đồng đều và phải lấy mẫu định kỳ sau 24 giờ, do đó tốn nhiều thời gian khảo sát [107]. Một số sản phẩm trao đổi chất và thông số khác có liên quan đến sự phát triển của vi sinh vật như các enzyme ngoại bào, hàm lượng ATP, hàm lượng ADN, tốc độ tiêu thụ cơ chất, … cũng có thểđược sử dụng như yếu tố trung gian để xác định khả năng hình thành sinh khối, trong đó:
- Phương pháp xác định hàm lượng ATP trong canh trường LBR [22].
- Phương pháp xác định hàm lượng ADN dựa trên cơ sở là sự không đổi của hàm lượng ADN có trong tế bào. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp là khó đảm bảo tính đại diện của mẫu và sự tích luỹ hàm lượng ADN của tế bào. Nhược điểm khác là tốn nhiều thời gian tách chiết, tinh sạch và thực hiện các thủ thuật trong xác định hàm lượng ADN [107].
Ngoài ra, còn có các phương pháp khác như: phương pháp xác định hệ số hô hấp, phương pháp đo sự giảm áp, phương pháp dựa vào các cơ quan phát triển tại các đỉnh phân nhánh của hệ sợi nấm, phương pháp cân bằng khối lượng, phương pháp cân bằng nước và phương pháp cân bằng nhiệt.
Tóm lại, trong LBR không có phương pháp phổ biến chung để xác định sinh khối. Theo Graciele và cộng sự [67, 68], không có phương pháp nào được xem là thích hợp cho mọi trường hợp. Vấn đề quan trọng là xác định đúng mục đích nghiên cứu để chọn tiêu chuẩn đánh giá phù hợp. Trong nhiều nghiên cứu và ứng dụng, không cần thiết phải xác định tổng hàm lượng sinh khối nhưng khi tính toán hiệu suất, tối ưu một sản phẩm trao đổi chất nào đó, đặc biệt là sản phẩm trao đổi chất bậc hai thì việc xác định sinh khối là rất cần thiết [52].
1.2.4 Lên men bán rắn nấm men Rhodotorula
Carr và cộng sự (1979-1980) đã phân lập được từ hạt cocoa thu được từ quá trình lên men hạt cacao tươi có sự hiện diện của Rhodotorula spp. Khi khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố nhưđộ thoáng khí, độ pH, nồng độ ethanol và nồng độ cơ chất thích hợp cho quá trình lên men cacao, Carr cho rằng trong tự nhiên có nhiều nấm men có khả năng lên men cacao, trong sốđó có Rhodotorula spp. Từ kết quả nghiên cứu này, Carr đưa ra kết luận là nấm men Rhodotorula spp. có khả năng LBR [121].
Nghiên cứu của Jacob (1991) [80] khi LBR nấm men Rhodotorula gracilis trên môi trường cơ chất là cám mì có bổ sung các nguồn dinh dưỡng khác nhau có thể tóm lược như sau: Hàm lượng lipid trong môi trường cơ bản ban đầu (gồm cám mì, mật rỉ có bổ
sung khoáng chất) là 3,5%. Sau lên men hàm lượng lipid tăng lên đến 69,8%. Sản phẩm sau LBR chứa sắc tố carotenoid, tiền vitamin B12, giàu chất béo và nhiều acid béo không bão hòa đã được dùng làm nguyên liệu bổ sung vào thức ăn chăn nuôi. Kaur B. và cộng sự (2009) [86] đã tiến hành LBR để xác định hàm lượng carotenoid do Rho. rubra MTCC 1446 tổng hợp khi nuôi cấy bề mặt trên môi trường thạch MYEBCW chứa 1,5% (w/v) agar, với MYEB (malt extract: 3 g/l, peptone: 5 g/l, yeast extract: 3 g/l, glucose: 10 g/l) được bổ sung 10% v/v nước dừa (CW: coconut water). Qua các tài liệu tổng kết được cho thấy nghiên cứu về LBR nấm men Rhodotorula trên thế giới rất ít và chủ yếu là các nghiên cứu về lên men chìm. Dưới đây, chúng tôi sơ lược qua các yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy nấm men Rhodotorula.
1.2.5 Các yếu tốảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy nấm men Rhodotorula 1.2.5.1 Ảnh hưởng của nguồn giống 1.2.5.1 Ảnh hưởng của nguồn giống
Trong công nghệ lên men, chủng giống vi sinh vật là vấn đề rất quan trọng. Đặc biệt với nấm men Rhodotorula là giống có khả năng sinh tổng hợp carotenoid không giống nhau giữa các chủng giống (xem bảng 1.2). Khả năng này phụ thuộc rất nhiều vào đặc tính di truyền của chủng giống dùng trong nghiên cứu [116].
Ngoài đặc tính di truyền của chủng giống, quá trình nuôi cấy vi sinh vật còn phụ thuộc nhiều vào các yếu tố dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy. Tuy nhiên nhưđã đề cập ở trên, từ trước đến nay nấm men Rhodotorula được nghiên cứu nhiều theo kỹ thuật lên men chìm, rất ít nghiên cứu đã công bố về khả năng phát triển trên môi trường rắn của nấm men này. Do đó trên cơ sở tài liệu hiếm hoi thu được từ các quá trình nuôi cấy bán rắn, chúng tôi tổng kết sơ lược các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men chìm của nấm men Rhodotorula như sau:
1.2.5.2 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng
- Ảnh hưởng của nguồn carbon
Theo Martin (1993) [100], thành phần môi trường để vi sinh vật sinh tổng hợp sắc tố không phụ thuộc vào việc nuôi cấy nhằm mục đích trích ly sắc tố hay thu sinh khối cực
đại. Tuy nhiên cũng có nhiều công bố cho rằng nguồn carbon ảnh hưởng rất lớn đến khả năng phát triển, khả năng tổng hợp sắc tố, đến thành phần sắc tố và thành phần các acid béo của nấm men Rhodotorula [14, 48, 66]. Theo Müncnerová D. và Augustín J. nhiều loài thuộc giống Rhodotorula có thể sử dụng được nguồn carbon là benzoate [109] hay glycerol [99].
Rhodotorula có khả năng sử dụng nhiều nguồn hydrocarbon mạch dài [91, 122], cũng như dễ dàng đồng hóa nguồn glucid từ các phế phụ phẩm của ngành công, nông nghiệp thực phẩm [14] như: bột mì, bột bắp, dịch chiết bột đậu nành, dịch chiết bột ngô [37-39, 144], nước sữa tách ra từ công nghệ sản xuất pho mát [55-57, 136], nước muối dưa cải [135], nước chiết than bùn [100], rỉ đường mía [27], rỉđường củ cải [87], nước ép nho [38].
Như vậy, nấm men Rhodotorula có khả năng sử dụng nhiều nguồn glucid khác nhau. Đặc biệt là khả năng sử dụng nguồn carbon mạch dài và thực tế Jacob (1991) đã dùng cám mì để LBR nấm men Rhodotorula gracilis [80]. Đây chính là cơ sở để chúng tôi chọn gạo tấm đã qua hồ hoá (có bổ sung dưỡng chất) để làm cơ chất chính cho quá trình LBR nấm men nghiên cứu.
- Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Nguồn nitơ có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula và sự ảnh hưởng này còn tùy thuộc vào khả năng sử dụng các nguồn nitơ của từng chủng giống [89]. Theo Khaled M. và cộng sự (1990) hai nguồn nitơ vô cơ có ảnh hưởng lớn đến khả năng tổng hợp carotenoid tổng của Rhodotorula là NH4NO3 và (NH4)2SO4. Khi Rhodotorula sử dụng nitơ ở dạng NH4+ sẽ kích thích quá trình tích lũy sinh khối cực đại. Trong khi đó, nếu nitơ ở dạng NO3- thì sẽ cho hiệu suất thu hồi sinh khối chỉ ở mức trung bình nhưng hàm lượng carotenoid tổng (theo Klg sinh khối khô) tăng lên rất lớn [87]. Ngược lại, nguồn nitơ hữu cơ như: glycine, valine, asparagine và leucine không ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp carotenoid [129]. Tỷ lệ C/N thích hợp cho nấm men Rhodotorula từ 30 ÷ 50 [66, 129, 147].
- Ảnh hưởng của khoáng chất
Giống nấm men Rhodotorula thích hợp với môi trường nước biển [24] và môi trường muối kim loại kiềm [88]. Một số loài nấm men thuộc giống Rhodotorula bị ức chếở nồng độ muối trên 5%, trong trường hợp này khả năng lên men của các nấm men càng thấp khi ở nồng độ muối càng cao [122]. Theo Bhosale P. và Grade R.V. [29], chủng đột biến Rh. glutinis mutant 32 cần được cung cấp thêm K2HPO4, KH2PO4 và MgSO4.7H2O vào môi trường. Tuy nhiên, thực tế nguồn khoáng cần bổ sung vào môi trường dinh dưỡng phụ thuộc nhiều vào nguồn cơ chất [87].
- Ảnh hưởng của các chất khác
Ngoài các nguồn dinh dưỡng chính như carbon, nitơ và khoáng chất thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy giống như nhiều quá trình nuôi cấy các sinh vật khác, các nấm men dầu cần bổ sung thêm các nguyên liệu chứa chất béo (gồm các loại dầu và các acid béo) để tích luỹ chất béo [89]. Khaled M. và cộng sự cho rằng các loại dầu thực vật như dầu hạt bông, dầu ôliu, dầu bắp và dầu thầu dầu đều làm tăng đáng kể khả năng tổng hợp chất béo, trong đó dầu hạt bông được xem là có tác dụng cao nhất [87]. Bên cạnh đó, một số chất được ghi nhận có tác dụng làm tăng hàm lượng carotenoid như:
- Phenol với nồng độ 500 ppm làm tăng hàm lượng beta-carotene lên đến 35%, giảm lượng torularhodin trong khi hàm lượng torulene hầu như không đổi [33].
- 2-(4-chlorophenyl)- triethylamine (CPTA) có tác dụng kích thích quá trình chuyển hóa vòng của các carotenoid như quá trình tạo vòng trực tiếp từ lycopene thành λ- carotene dẫn đến tăng hàm lượng beta-carotene [73].
1.2.5.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy
- Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nấm men Rhodotorula thường phát triển ở nhiệt độ 25 ÷ 30oC và khoảng nhiệt độ thích hợp là 27 ÷ 28oC [19]. Ở nhiệt độ 30oC, nếu có chiếu sáng vào cuối giai đoạn tăng trưởng logarith sẽ làm tăng lượng beta-carotene đồng thời giảm lượng torulene và
torularhodin. Khi hạ nhiệt độ từ 30oC xuống 25oC hàm lượng beta-carotene thu được tăng cao như ở bảng 1.3. Ở nhiệt độ 40oC, nấm men Rhodotorula hầu như không phát triển [89, 91, 129]. Sau đây là một kết quả minh hoạ:
Bảng 1.3 Sắc tố carotenoid do Rho. glutinis DBVPG 3853 tổng hợp được sau 120 giờ
trên môi trường nước ép nho ở các nhiệt độ khác nhau [38]
Nhiệt độ (oC) Carotenoid tổng (mg/l ) Carotenoid tổng (µg/g tế bào khô) Các sắc tố carotenoid (% carotenoid tổng)
β-carotene Torulene Torularhodin
25 4,99 831,7 16,0 18,0 60,1
30 5,95 915,4 9,3 9,4 78,9
35 5,08 736,2 5,9 9,8 78,7
- Ảnh hưởng của pH
Giống như các vi sinh vật khác pH thích hợp cho sự phát triển của nấm men
Rhodotorula khác nhau tùy từng loài, chủng. Giá trị pH thích hợp cho Rhodotorula
thông thường ở khoảng pH hơi acid từ pH 5 đến 6. Tuy nhiên, giá trị pH này còn phụ thuộc vào thành phần môi trường và nhiệt độ nuôi cấy [109].
- Ảnh hưởng của ánh sáng
Ánh sáng có ảnh hưởng đáng kểđến khả năng hình thành carotenoid cũng như thành phần carotenoid của nấm men [89]. Toàn bộ quá trình sinh tổng hợp sắc tố carotenoid của nấm men có thể chia thành 3 giai đoạn: giai đoạn cảm ứng ánh sáng (tối thiểu 12 giờ), giai đoạn tổng hợp các enzyme (giai đoạn này xảy ra trong tối) và giai đoạn tổng hợp carotenoid phụ thuộc vào ánh sáng [129]. Tuy nhiên, theo Tada Mikiro (1982) [144] mức độ hình thành carotenoid phụ thuộc vào cường độ chiếu sáng và qua hai giai đoạn. Giai đoạn đầu xảy ra phản ứng quang hóa không phụ thuộc vào nhiệt độ nhưng rất cần ánh sáng và giai đoạn thứ hai xảy ra các phản ứng hóa sinh không phụ thuộc vào ánh sáng. Thực tế, cường độ chiếu sáng có liên quan đến nhiệt độ nuôi cấy. Khi nuôi nấm men Rhodotorula ở nhiệt độ 30oC, hàm lượng beta-carotene giảm đáng kể nhưng nếu nấm men được chiếu sáng vào cuối giai đoạn phát triển logarith kết quả
lượng beta-carotene sẽ tăng 58% so với khi không chiếu sáng. Ngược lại, nuôi cấy ở nhiệt độ thấp (khoảng 20oC), hàm lựơng beta-carotene thu được khi nấm men được và không được chiếu sáng tăng (chênh lệch) không đáng kể [129].
- Ảnh hưởng của oxi
Quá trình tổng hợp carotenoid rất cần đến sự tạo thành của các hợp chất có tính oxi hóa cao do đó rất cần oxi [20]. Không khí đóng vai trò rất quan trọng, có liên quan đến sự hình thành sắc tốở nấm men và các vi sinh vật khác [35, 152]. Không khí còn có