Chúng tôi đã phân lập từ 64 mẫu (trong đó có 21 mẫu lá; 17 mẫu hoa, vỏ quả; 10 mẫu đất cát; 3 mẫu nước; 3 mẫu rác và 10 mẫu thực phẩm) có nguồn gốc như bảng 2.1. Mỗi mẫu lần lượt được phân lập trên các môi trường YMPG, YPG và PGA (xem thành phần ở mục 2.1.2). Trong từng trường hợp, chọn các khuẩn lạc đặc trưng có màu từ vàng, cam đến đỏ. Sau khi làm thuần và quan sát các đặc điểm hình thái tế bào dưới kính hiển vi, chúng tôi đã tuyển chọn được 17 dòng nấm men sinh sắc tố từ có màu từ vàng kem, hồng cam đến đỏ. Các nấm men này được ký hiệu lần lượt là MN1, MN2, MN3, MN4, MN5, MN6, MN7, MN8, MN9, MN10, MN11, MN12, MN13, MN14, MN15, MN16 và MN17 (hình 3.1).
Hình 3.1 Các nấm men sinh sắc tố carotennoid phân lập được
3.1.2 Chọn và định danh các nấm men thuộc giống Rhodotorula trên cơ sở thực hiện các thí nghiệm theo khoá phân loại của Kreger-van Rij
3.1.2.1 Chọn giống nấm men Rhodotorula
Tiến hành thực hiện các phản ứng sinh lý, sinh hóa đối với 17 nấm men sinh sắc tố carotenoid phân lập được ở trên để trả lời các câu hỏi trong việc định danh nhóm các giống nấm men tạo bào tử và không tạo bào tử theo khoá phân loại của Kreger-van Rij
(1984). Kết quả chúng tôi đã chọn được 8 chủng nấm men mang ký hiệu MN1, MN5, MN7, MN8, MN10, MN12, MN16 và MN17 thuộc giống Rhodotorula (khoá định danh nấm men đến giống của Kreger-van Rij, xem phụ lục 5.1.4) như hình 3.2
Hình 3.2 Giống nấm men Rhodotorula phân lập được
Hình thái tế bào và tốc độ phát triển của 8 chủng Rhodotorula phân lập được vào ngày nuôi cấy thứ 8 trên thạch đĩa được mô tảở bảng 3.1.
Bảng 3.1 Đặc điểm tế bào và tốc độ phát triển của 8 chủng phân lập được
Đặc điểm Ký hiệu Nguồn phân lập Hình thái tế bào Mô tả khuẩn lạc Tốc độ phát triển (mm) MN 1 Đất vườn Hình dài
Màu hồng cam hay đỏ cam, bề mặt nhẵn, bóng sáng, mép không có răng cưa, tâm khuẩn lạc nhô lên.
7 ÷ 10
MN 5 Vỏ táo Hình tròn
Màu hồng hay cam, to, tròn bề mặt khuẩn lạc mịn, nhẵn bóng, mép không răng cưa, dày. 10 ÷ 20 MN 7 Nước biển VT Hình tròn cầu
Màu vàng kem hay hồng cam, tròn, bề mặt khô mịn, mờ đục, mép không răng cưa, khuẩn lạc nhô lên ở tâm.
5 ÷ 15 MN 8 Mía bệnh đốm đỏ Hình tròn
Màu cam đến đỏ cam, to tròn, bề mặt gồ ghề, xếp mí, mép không có răng cưa, tâm khuẩn lạc dày đặc các nếp gấp.
MN 10 Lá dâm bụt Hình dài
Màu hồng cam hay đỏ, to, tròn nhẵn bóng, nhiều nhớt, mép không có răng cưa, khuẩn lạc tương đối dày như nhau tại tâm cũng như gần mép. 8 ÷ 14 MN 12 Lá lúa LA Hình trứng
Màu cam hay đỏ cam, to tròn, bề mặt khô nhẵn, mép không có răng cưa, bề dày khuẩn lạc trung bình. 12 ÷ 17 MN 16 Vỏ dưa lê Hình elip kéo dài
Màu cam hay đỏ, to tròn đôi khi gồ ghề, bề mặt hơi khô, xếp nhiều nếp, mép không có răng cưa, khuẩn lạc mỏng. 8 ÷ 13 MN 17 Hoa dâm bụt Hình tròn cầu
Màu cam, to hình ovan, bề mặt khô, mịn , mép khuẩn lạc không có răng cưa, khuẩn lạc mỏng hơi nhô lên ở tâm.
7 ÷ 12
3.1.2.2 Khảo sát các đặc điểm sinh hóa và định danh loài của 8 chủng nấm men
Rhodotorula phân lập được
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát đặc điểm sinh lý và sinh hóa của 8 chủng Rhodotorula phân lập được
Số
TT Thí nghiệm thực hiện
Ký hiệu nấm men Rhodotorula phân lập được
MN1 MN5 MN7 MN8 MN10 MN12 MN16 MN17 1. Nang bào tử - - - - 2. Sự tiếp hợp - - - - 3. Giả sợi nấm - - - - 4. Khuẩn ty thể - - - - 5. Bào tử bắn - - - - 6. Urease + + + + + + + + 7. DBB (diazonium blue B) + + + + + + + + 8. Phát triển ở 200C + + + + + + + + 9. Phát triển ở 300C + + - - + + - -/+ 10. Phát triển ở 370C - - - - - - - -
11. Lên men glucose - - - -
12. Hình thành hợp chất tinh bột - - - -
14. D-galactose + + + + + + + + 15. Lactose - - - - 16. Sucrose + + + + + + + + 17. Maltose + - + - + + - + 18. Cellobiose + + - - - V 19. D-xylose + + + + + + + + 20. L-Arabinose - - - - 21. D-Trehalose + + - - - - 22. Melezitose + - + - + + - + 23. Raffinose V + + - + + - + 24. L-Arabitol - + - - - - 25. Glycerol + + + + + + + + 26. Melibiose - - - + - - 27. Inositol - - - - 28. Potassium nitrate + + + - + + - +
Ghi chú: (-): phản ứng âm tính; (+): phản ứng dương tính; V(-/+): phản ứng yếu, không rõ.
Tiến hành khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các nấm men Rhodotorula
phân lập được trên bộ Test ID32E và trên các môi trường phân lập ở thạch đĩa và trong ống nghiệm (xem hình ở phụ lục 5.16.1). Các kết quảđược trình bày ở bảng 3.2.
Kết hợp quan sát các đặc điểm hình thái sinh lý tế bào, khuẩn lạc và các đặc điểm sinh hóa của các nấm men thuộc giống Rhodotorula và căn cứ vào khóa định danh của Kreger-van Rij, chúng tôi kết luận như sau:
- Nấm men ký hiệu MN5 là Rh. graminis; - Nấm men ký hiệu MN7 là Rh. ingeniosa;
- Hai chủng MN10 và MN17 đều là Rh. glutinis nên được ký hiệu lần lượt là Rh.
glutinis HUI-1 và Rh. glutinis HUI-2;
- Bốn nấm men có ký hiệu MN1, MN8, MN12 và MN16 chưa đủ cơ sở để định danh đến loài nên chúng được ký hiệu lần lượt là: Rhodotorula sp.1 (MN1),
3.1.3 Chọn chủng nấm men nghiên cứu chính từ các chủng phân lập được trên cơ sở khả năng sinh tổng hợp beta-carotene
Cấy cùng tỷ lệ giống khoảng 2 x 107 CFU/g môi trường và tiến hành LBR 8 loại nấm men Rhodotorula phân lập được trong cùng điều kiện. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của chúng ở ngày lên men thứ 7 trên môi trường cơ bản (xem mục 2.2.2.1), kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của các chủng nấm men Rhodotorula trên môi trường cơ bản
Ký hiệu nấm men Hàm lượng beta-carotene (ppm theo CK)
MN1 14,48 ± 3,81c MN5 27,77 ± 7,03 b MN7 3,98 ± 0,97 d MN8 4,42 ± 1,43d MN10 16,70 ± 2,18 c MN12 42,55 ±±±± 3,57 a MN16 5,10 ± 2,06 d MN17 2,46 ± 0,42 d
(Các giá trị có chỉ số mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa ở mức α = 0,05)
Kết quả thí nghiệm cho thấy, bốn nấm men có ký hiệu MN7, MN8, MN16 và MN17 hầu như không phát triển trên môi trường cơ bản đã chọn. Bốn chủng giống có ký hiệu MN1, MN5, MN10 và MN12 có khả năng LBR và sinh tổng hợp beta-carotene trên môi trường cơ bản, tuy nhiên hàm lượng beta-carotene do bốn chủng nấm men này tổng hợp không giống nhau và khác biệt ở mức ý nghĩa α = 0,05.
Thực nghiệm khảo sát khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của 8 chủng nấm men
Rhodotorula phân lập được trình bày ở bảng 3.3. Bảng 3.3 cho thấy MN12 là nấm men có khả năng sinh tổng hợp beta-carotene cao nhất (xem kết quả phân tích bằng kỹ thuật HPLC ở phụ lục 5.7.1 và phân tích anova ở phụ lục 5.7.2), do đó MN12 được chọn làm chủng giống nghiên cứu chính. Bên cạnh phương pháp định danh dựa vào các đặc điểm
sinh lý, sinh hóa theo khoá phân loại của Kreger-van Rij (1984) chúng tôi cũng gửi mẫu nấm men MN12 đến Công ty Nam Khoa đểđịnh danh.
Bằng phương pháp giải trình tự 28S DNA và tra cứu trên blast search, kết quảđịnh danh nấm men MN12 thu được như sau:
- Trật tự sắp xếp các nucleotid có kết quả:
Hình 3.3 Trình tự nucleotid đoạn 28S DNA
Hình 3.4 Giải trình tự 28S DNA của chủng MN12
- Tra cứu trên bằng phần mềm blast search:
Hình3.5 Kết quả tra cứu trình tự 28S DNA của chủng MN12
Qua việc giải trình tự 28S DNA và tra cứu trên blast search, cho kết quả với độ tương đồng 100% với chủng Rhodotorula sp. CBS 10104 trong dữ liệu ngân hàng NCBI (xem phụ lục 5.8). Vậy trong luận án này, để thuận lợi cho việc trình bày chúng
tôi thống nhất gọi nấm men Rhodotorula sp.3 (MN12) là Rhodotorula.
3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ
RHODOTORULA THEO PHƯƠNG PHÁP BÁN RẮN
3.2.1 Khảo sát các phương pháp phá vỡ thành tế bào nấm men
3.2.1.1 Khảo sát hệ dung môi trích ly và bước sóng cho độ hấp thu cực đại
Tiến hành thí nghiệm khảo sát hệ dung môi trích ly và bước sóng tại đó dung dịch có độ hấp thu cực đại (như mục 2.2.1.1) (xem số liệu thực nghiệm và đồ thị ở phụ lục 5.7.3). Kết quả này cho thấy mỗi hệ dung môi sẽ có độ hấp thu cực đại tại các bước sóng khác nhau. Với dung dịch sử dụng hệ dung môi trích ly là DM2 và DM5 cho độ hấp thu cực đại ODmax tại bước sóng lần lượt là 457 và 458 nm. Các DM1, DM3 và DM4 đều có ODmax tại bước sóng λ = 454 nm, trong đó DM3 có giá trị OD lớn nhất và có ý nghĩa khác biệt so với các hệ dung môi khác ở cùng nồng độ chất chuẩn. Hệ DM3 có khả năng hòa tan tốt beta-carotene so với các hệ dung môi khảo sát. Theo Rodney F. B. (1993), beta-carotene trong dung môi không phân cực diethyl ether có độ hấp thu cực đại λ max = 449,8 nm nhưng trong dung môi phân cực acetone lại có độ hấp thu cực đại tại λ max = 454 nm [125]. Như vậy, kết quả khảo sát thu được λmax của beta-carotene trong hệ DM3 và trong dung môi acetone là như nhau và bằng 454 nm. Nghiên cứu của Bhosale P. và cộng sự (2003) cũng dùng hệ DM3 để tách carotenoid từ Rh. glutinis
NCIM 3353 bằng phương pháp HPLC nhưng tại bước sóng λmax = 457 nm [29].
Kết quả chọn hệ dung môi DM3 gồm acetonitrile: 2-propanol: ethyl acetate = 40: 40: 20 (theo thể tích) và bước sóng λmax = 454 nm để xác định hàm lượng beta-carotene trong các bước nghiên cứu tiếp theo.
3.2.1.2 Dựng đường chuẩn beta-carotene trong hệ dung môi DM3
Chất chuẩn beta-carotene của Sigma Chemical Co.( Mỹ) có mã số C9750-5G được pha thành các dung dịch có nồng độ 5, 10, 15, 20 và 30 ppm trong hệ DM3. Tiến hành thí nghiệm như mục 2.2.1.2 và dựng được đường chuẩn có dạng y = 14,152 x (xem đồ
thị đường chuẩn ở phụ lục 5.7.4), trong đó y là hàm lượng beta-carotene (ppm) và x là mật độ quang OD. Phương trình này được sử dụng để xác định hàm lượng beta- carotene trong các mẫu nghiên cứu bằng phương pháp quang phổ UV-Vis.
3.2.1.3 Phương pháp phá vỡ thành tế bào hiệu quảđể xác định hàm lượng beta- carotene
Tiến hành nuôi Rhodotorula theo phương pháp bán rắn với quy trình và thông số kỹ thuật như mục 2.2.1.3 và bố trí thí nghiệm như bảng 2.2. Lấy mẫu canh trường ở ngày lên men thứ 7 LBR để tiến hành xác định hàm lượng beta-carotene theo 21 nghiệm thức (NT) phá vỡ tế bào (xem mục 2.2.1.3) bằng hệ dung môi DM3. Kết quả thu được trình bày ở biểu đồ 3.6 (số liệu thí nghiệm và phân tích anova ở phụ lục 5.9).
Hình 3.6 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng beta-carotene thu được theo các phương pháp phá vỡ tế bào
Hiện nay, đã có nhiều công bố khoa học [25-27, 36, 56, 114, 145] về phương pháp thu nhận sinh khối và tách chiết sắc tố carotenoid cũng như beta-carotene của
Rhodotorula được nuôi cấy theo kỹ thuật lên men chìm. Nghiên cứu nuôi cấy
Rhodotorula trên môi trường rắn và phá vỡ tế bào nấm men có lẫn trong các hạt cơ chất rắn là một nghiên cứu hoàn toàn mới của chúng tôi, chưa được đề cập bất kỳ trong một công trình nào. Việc tách sinh khối ra khỏi cơ chất có cấu trúc xơ hay hạt là rất khó nên mục tiêu của thí nghiệm này là tìm ra cách phá vỡ thành tế bào có hiệu quả cao
để tách chiết sắc tố nội bào trong điều kiện tế bào nấm men Rhodotorula lẫn trong các hạt cơ chất rắn.
Từ kết quả thực nghiệm, chúng tôi rút ra một số nhận xét sau:
- Với các NT phá tế bào bằng phương pháp tự phân và nghiền với bột thủy tinh
Phương pháp tự phân và nghiền với bột thủy tinh là phương pháp phổ biến thường dùng để phá vỡ tế bào khi thu nhận enzyme hay sắc tố nội bào trong phòng thí nghiệm. Phương pháp này chỉ thích hợp với một lượng nhỏ tế bào đã được tách ra khỏi môi nuôi cấy. Trường hợp tế bào còn lẫn trong cơ chất rắn dạng hạt, chúng tôi nhận thấy phương pháp tự phân và nghiền với bột thủy tinh cho hiệu suất tách chiết không cao do cơ chế tác động của bột thủy tinh lên tế bào không triệt để. Đồng thời, cơ năng tác động lên mẫu trong quá trình nghiền một phần biến thành nhiệt năng làm thất thoát beta-carotene. Tuy nhiên, nếu kết hợp với làm lạnh trong quá trình nghiền mẫu thì có thể khắc phục sự thất thoát beta-carotene do tác động của nhiệt độ.
- Với các NT phá tế bào bằng dung môi DMSO và chế phẩm chitinase
Theo Diego và cộng sự (2006), dung môi DMSO có khả năng phá vỡ mạnh thành tế bào Rhodotorula để tách chiết sắc tố carotenoid [48]. DMSO là hợp chất hữu cơ có khả năng hoà tan hay tác dụng với các chất trong tế bào chất tạo ra các lỗ thủng trên thành tế bào nên có tác dụng tách chiết các chất bên trong tế bào. Theo chúng tôi, DMSO chỉ có tác dụng tốt đối với sinh khối tế bào được tách ra từ quá trình lên men chìm. Với LBR, sinh khối còn lẫn trong các hạt cơ chất rắn nên hiệu quả phá vỡ tế bào của DMSO (NT4) không cao, chỉ đạt 16,87% so với NT13. Nếu sử dụng DMSO kết hợp với sử dụng sóng siêu âm có bổ sung bột thuỷ tinh (NT7), có thể đạt 77,29% so với NT13. Chế phẩm chitinase có tác dụng phá vỡ thành tế bào cao hơn so với DMSO. Việc sử dụng chitinase để phá vỡ thành tế bào là phương pháp có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao vì đây là hợp chất tương thích sinh học. Tuy nhiên, kết quả khảo sát cho thấy khi dùng DMSO hay chitinase đều cần kết hợp với phương pháp nghiền cơ học hoặc sóng siêu âm thì hiệu quả phá vỡ tế bào mới được cải thiện đáng kể.
- Với các NT phá tế bào bằng phương pháp lạnh đông và rã đông
Các NT liên quan đến xử lý lạnh đông luôn cho kết quả phá vỡ thành tế bào cao hơn các NT qua cấp đông. Ở nhiệt độ -5oC đến -1oC của quá trình lạnh đông, gần nhưđa số nước tự do có trong mẫu kết tinh thành nước đá với tinh thể to và sắc nên khi rã đông ở nhiệt độ 55 ± 1oC các tinh thể đá này sẽ đâm thủng thành tế bào mạnh hơn so với phương pháp cấp đông nên có khả năng phá vỡ thành tế bào tốt hơn. Phương pháp lạnh đông không tiêu tốn nhiều năng lượng như phương pháp cấp đông nhưng cho hiệu quả phá vỡ tế bào và hàm lượng beta-carotene xác định được cao hơn. Phương pháp lạnh đông và rã đông được xem là phương pháp phổ biến để phá vỡ thành tế bào trong các nghiên cứu tại phòng thí nghiệm.
- Với các NT có xử lý tế bào bằng sóng siêu âm
Qua bảng 3.4 cho thấy hàm lượng beta-carotene ở các NT có qua xử lý tế bào bằng sóng siêu âm luôn cao hơn so với các NT khác. Kết quả thí nghiệm cho thấy dùng sóng siêu âm là phương pháp phá vỡ tế bào nhanh và hiệu quả, trong đó ở NT13 hàm lượng beta-carotene thu được đạt giá trị cao nhất.
Phương pháp phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm có bổ sung bột thủy tinh luôn cho hiệu quả cao hơn so với trường hợp không bổ sung bột thủy tinh. Đây được xem là phương pháp hiệu quả vì bột thủy tinh sẽ hỗ trợ rất tốt cho các tia sóng len lỏi vào bên trong tế bào.
Như vậy, kết quả khảo sát thu được cho thấy phương pháp xử lý nhiệt (lạnh đông - rã đông) kết hợp với sóng siêu âm trong hệ dung môi có bổ sung bột thủy tinh là