III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.2. Phân lập và nhân giống 2 chủngNitrosomonas sp và Nitrobacter sp
a. Phân lập và chọn giống
Lấy 1g đất trồng rau sâu khoảng 5-10cm, hòa vào 9ml nước cất, ly tâm loại cặn, pha loãng đến nồng độ thích hợp. Dùng pipetman hút 0,1ml dung dịch cho vào đĩa Petri có chứa môi trường Winogradsky P1; dùng que cấy, cấy trải dàn đều trên dung dịch mặt thạch. Ủ ở 28 ± 2oC trong 4 ngày, chọn và tách những khuẩn lạc tương đối rời.
Dùng que cấy vòng lấy một ít giống vi khuẩn hòa tan trong nước cất, cấy ria lên dĩa Petri chứa môi trường Winogradsky P1. Ủ 4-5 ngày ở nhiệt độ 30oC. Quan sát hình dáng của tế bào và sự sắp xếp của màng tế bào chất theo các tiêu chí phân loại vi khuẩn. (Hình 3.5)
Bảng 3.3 : Các đặc điểm phân loại vi khuẩn Nitrosomonas sp.
TT Đặc điểm Vi khuẩn Nitrosomonas sp
1 Hình dạng Có dạng cầu, một số có dạng bầu dục 2 Kích thước (μm) 0,7 – 1,5 x 1,0 – 2,4
3 Kiểu tiên mao Mọc ở cực
4 Cấu trúc màng Màng bao tế bào chất có các lỗ nằm rãi rác đôi khi các màng này gấp cuộn vào bên trong tế bào chất.
5 Nhuộm Gram Thuộc loại Gram âm không di động
b. Nhân giống
Nuôi cấy chủng vi khuẩn Nitrosomonas sp trong bình lên men có chứa 1 lít dung dịch môi trường Watson ở nhiệt độ 30oC.
Theo dõi quá trình lên men bằng kỹ thuật đếm tế bào trực tiếp dưới kính hiển vi bằng buồng đếm hồng cầu (Bảng 3.4). Sau 4 ngày nuôi cấy mật độ chủng Nitrosomonas sp trong dung dịch là: CFU/ml = 1,4 x 108.
35
Bảng 3.4: Mật độ chủng Nitrosomonas sp thay đổi theo thời gian nuôi cấy ở pH = 7 và to = 30oC.
TT Thời gian (giờ) pH to(C) Mật độ tế bào (CFU/ml)
1 12 7 30 1,2 x 106 2 24 7 30 7,4 x 106 3 36 7 30 2,2 x 107 4 48 7 30 5,6 x 107 5 60 7 30 0,8 x 108 6 72 7 30 1,1 x 108 7 84 7 30 1,3 x 108 8 96 7 30 1,4 x 108 c. Giữ giống
Đưa chủng Nitrosomonas sp vào môi trường giữ giống Winogradsky P1 trong ống nghiệm thạch nghiêng bảo quản ở 4oC.
3.1.2.2. Phân lập và nhân giống chủng Nitrobacter sp
a. Phân lập và chọn giống
Lấy 1g đất trồng rau sâu khoảng 5-10cm hòa vào 9ml nước cất, ly tâm loại cặn, pha loãng đến nồng độ thích hợp. Dùng pipetman hút 0,1ml dung dịch cho vào đĩa Petri có chứa môi trường Winogradsky P2; dùng que cấy, cấy trải dàn đều trên dung dịch mặt thạch. Ủ ở 28 ± 2oC trong 4 ngày, chọn và tách những khuẩn lạc tương đối rời.
Dùng que cấy vòng lấy một ít giống vi khuẩn hòa tan trong nước cất, cấy ria lên dĩa Petri chứa môi trường Winogradsky P2 mới pha. Ủ 4-5 ngày ở nhiệt độ 30oC. Quan sát hình dáng của tế bào và sự sắp xếp của màng tế bào chất theo các tiêu chí phân loại vi khuẩn. (Hình 3.6).
Bảng 3.5: Các đặc điểm phân loại vi khuẩn Nitrobacter sp.
TT Đặc điểm Vi khuẩn Nitrobacter sp
1 Hình dạng Có dạng cầu, đôi khi có hình quả lê hay que ngắn 2 Kích thước (μm) 0,6 – 0,8 x 1,0 – 2,0
3 Kiểu tiên mao Mọc ở gần cực, đuôi và bên hông
4 Cấu trúc màng Carboxysome hiện diện ở tế bào chất ở dạng thể vùi trong nguyên sinh chất. Vách tế bào có thêm một lớp vỏ bọc bên
36
ngoài được cấu trúc bởi các tiểu đơn vị protein ghép với nhau theo một trật tự nhất định.
5 Nhuộm Gram Thuộc loại Gram âm di động nhờ tiên mao ở đuôi và bên hông.
b. Nhân giống
Nuôi cấy chủng vi khuẩn Nitrobacter sptrong bình lên men có chứa 1 lít dung dịch môi trường Hall-Murphy ở nhệt độ 30oC.
Theo dõi quá trình lên men bằng kỹ thuật đếm tế bào trực tiếp dưới kính hiển vi bằng buồng đếm hồng cầu (Bảng 3.6). Sau 5 ngày nuôi cấy mật độ chủng Nitrobacter sptrong dung dịch là: CFU/ml = 1,15 x 108.
Bảng 3.6: Mật độ chủng Nitrobacter spsau 5 ngày nuôi cấy ở pH = 7 và to = 30oC.
TT Thời gian (giờ) pH to(C) Mật độ tế bào (CFU/ml)
1 24 7 30 1,73 x 106 2 48 7 30 8,25 x 106 3 72 7 30 2,43 x 107 4 96 7 30 9,86 x 107 5 120 7 30 1,15 x 108 c. Giữ giống
Đưa chủng Nitrobacter sp vào môi trường giữ giống Winogradsky P2 trong ống nghiệm thạch nghiêng bảo quản ở 4oC.
37 (a) (a) (b) Hình 3.5: Hình dạng khuẩn lạc Nitrosomonas sp. a) Sau 4 ngày b) Sau 9 ngày
38 (a) (b) Hình 3.6: Hình dạng khuẩn lạc Nitrobacter sp. a) Sau 4 ngày b) Sau 9 ngày
39
3.1.3. Thử nghiệm tính sát khuẩn của 6 hoạt chất ARLx trích từ hạt neem đối với 2 chủng Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp theo phƣơng pháp kháng sinh đồ